ME丨天津大学卢文玉教授团队构建酿酒酵母过氧化物酶体高效生产倍半萜正交转运系统

亚细胞区室化是真核细胞的一项关键进化特征，为构建高效生产天然产物的人工生物系统带来了固有优势，而构建人工蛋白质转运系统是开发高效人工生物系统的关键起始步骤。酿酒酵母是真核生物，具有明确的遗传背景，并且在工业应用上展现出诸多优势，例如对低pH、渗透压以及多种抑制剂具有高耐受性。酿酒酵母拥有多种膜性细胞器，这些细胞器不仅在细胞生存过程中扮演着至关重要的角色，而且在天然产物的合成方面也具有重要意义。萜类化合物在制药和化学领域应用广泛。酿酒酵母具有内源性甲羟戊酸（Mevalonate，MVA）途径，该途径在合成天然植物萜类化合物方面优势显著。同时，过氧化物酶体作为合成萜类的亚细胞区室也具备一定的有利条件。在此背景下，本研究通过构建正交的过氧化物酶体转运系统，成功解决了在酿酒酵母中高效生产倍半萜的问题。该研究不仅为构建人工过氧化物酶体细胞工厂提供了关键技术支撑，也为在酵母中高效合成倍半萜类天然产物提供了可行方案。

该研究基于已有的通过融合拟南芥来源的AtPEX5*的C端序列与小立碗藓来源的野生型PEX5的N端序列结合得到的增强信号肽PTS1*（WWRDPYSPMYQSYY），设计了一种融合酿酒酵母来源的ScPEX5的N端序列和南芥来源的AtPEX5*的C端序列得到的过氧化物酶体转运蛋白ScPEX5*（图1A）。随后通过荧光蛋白共定位试验，选取过氧化物酶体基质蛋白Pcs60信号肽的C端作为内源性对照，将红色荧光蛋白与内源性PTS1融合，绿色荧光蛋白与PTS1*融合后。接着，将转运系统对整合到酿酒酵母BY4741中得到不同菌株。通过对比这些菌株的荧光结果（图1B），初步构建并证明了正交系统PEX5*-PTS1*的可行性。最后为评估ScPEX5*的特异性，根据C端三肽特征将信号肽分为10类，并通过荧光蛋白共定位实验对其余9种信号肽进一步验证，从而证明了ScPEX5*-PTS1*系统的正交性。

图1 酿酒酵母过氧化物酶体正交转运系统的建立

研究首先重建了PDV通路在酿酒酵母BY4741中的表达（图2A），并通过不同的信号肽融合VioE，生成了多个实验株（LC01、LC02、LC03和LC04）。随后，研究评估了这些株中PDV产量和颜色变化，并以此作为评估转运效率的指标（图2B）。结果显示，F2和F2Q株中观察到的绿色荧光表明ScPEX5*-PTS1*的转运效率较低（图2B），而内源性运输系统ScPEX5-PTS1的转运效率高于ScPEX5*-PTS1*，这与测量的PDV产量呈正相关（图2C）。

图2 一种与PDV相关的过氧化物体蛋白转运效率评估检测方法

为提高ScPEX5*-PTS1*系统在酵母细胞中过氧化物体的蛋白运输效率，采用PDV高通量筛选系统对由（DNK）₉引物构建的9肽文库进行筛选。研究发现，转化了VioE-9AA_DNK序列文库的株LC01的颜色由浅变深，反映了靶向过氧化物酶体的VioE输入效率的差异（图3A）。随后，选择颜色较浅的菌株进行测序，删除含终止密码子的序列，获得了265个独特克隆的连接序列。根据来自Pcs60的ePTS1（LGRGRRSKL）和内源性PTS1的强度，将筛选的连接序列分为三类（图3B）。接着，从这三类中随机选择信号肽来确定PDV的产量（图3C和D），筛选出了最优信号肽oPTS1*（YERVTTMTNYQSYY），并发现它的结构特点与内源性运输系统有显著差异。在最终的实验中，尝试了人工设计的最优序列uPTS1*，尽管其PDV产量有所提高，但这说明ScPEX5*和信号肽之间的结合机制依然需要深入研究，以了解其转运效率增强的具体机制。

为了进一步研究不同信号肽在增强过氧化物酶体内萜类化合物产生方面的功效，研究人员选择了四种靶向信号肽，PTS1*（低水平）、mPTS1*（中等水平）、oPTS1*（高水平）和ePTS1（内源性最佳靶向信号肽），分别构建过氧化物酶体内MVA（MVA）的合成途径（图4A）。这些信号肽用于转运参与MVA途径的三种关键蛋白，（ERG10、ERG13和HMGR），促进过氧化物酶体内MVA的从头合成。研究人员将ScPEX5*整合到酿酒酵母BY4741的Trp1位点中，通过删除BY4741中的Gal80重写半乳糖诱导表达系统，产生菌株LC10。随后将过氧化物酶体靶向信号PTS1*、mPTS1*和oPTS1*分别添加到ERG10、ERG13和tHMG1的C端序列，并整合到LC10菌株的基因组中，分别产生菌株LC12（PTS1*）、LC13（mPTS1*）和LC14（oPTS1*）。相应工程株LC12、LC13和LC14均显著提高MVA产量（图4B）。携带oPTS1*信号肽的菌株（LC14）表现出79.92 mg/L/OD₆₀₀的MVA产量，比含有PTS1*的菌株（LC12）高80%。随后通过将正交系统ScPEX5*-oPTS1*与内源性最佳信号肽ePTS1进行比较来评估其转运能力。首先使用ePTS1来表达三个MVA生物合成基因，得到菌株LC11。接着将P_TDH3-ScPEX5-T_CYC1和P_PEX5-ScPEX5*-T_PEX5模块分别引入LC11和LC14菌株中，得到菌株LC11-2和LC14-2。结果表明，菌株LC11-2（MVA-ePTS1）和LC14-2（MVA-oPTS1*）分别产生1.91 g/L和2.66 g/L的MVA（图4C）。为了探索内源性和正交转运系统的协同作用，MVA途径基因ERG10、ERG13和tHMG1分别使用ePTS1和oPTS1*信号肽在过氧化物酶体中重新表达，得到CE01和CE02。然后使用ePTS1在LC14-2中过表达MVA途径基因以得到菌株CE03，其允许通过利用内源系统ScPEX5-ePTS1和正交系统ScPEX5*-oPTS1两者来合成MVA。菌株CE01（2 × ePTS1）、CE02（2 × oPTS1*）和CE03（ePTS1 + oPTS1*）的MVA产量均低于原始菌株，分别为1.49 g/L、1.89 g/L和1.77 g/L。虽然发酵得到的MVA产量均低于LC14-2，但CE02菌株仍然表现出相对较高的MVA产量。

图4 酿酒酵母中MVA的过氧化物酶体合成

α-石竹烯是一种在植物中发现的倍半萜，具有强效的抗炎和抗癌特性。在酿酒酵母中，倍半萜生物合成由FPP启动，FPP由8种MVA途径酶从乙酰辅酶A合成。该研究将α-石竹烯作为模型化合物，以评估ScPEX5*-oPTS1*正交转运系统在建立萜类天然产物的细胞工厂中的效果（图5A）。采用ePTS1和oPTS1*各自的信号肽将参与α-石竹烯生物合成的途径酶导向过氧化物酶体，产生菌株LC11-3和LC14-3。菌株LC11-3（ePTS1-based）和LC14-3（oPTS1*-based）的α-石竹烯产量分别为59.80 mg/L和94.33 mg/L（图5B），相比菌株LC11-3提高了1.58倍。为了进一步提高产量，通过在含有tHMG1和HMGR过表达的LC10中共表达ERG20和zss1基因来工程化α-石竹烯生产株CE04。经过四天的摇瓶培养，产量达75.44 mg/L。随后，研究者采用ePTS1和oPTS1*转运系统分别成功构建了双细胞质/过氧化物酶体产生菌株LC11-4（细胞质/ePTS1）和LC14-4（细胞质/oPTS1*），其中LC14-4的α-石竹烯产量达302.48 mg/L，较LC11-4和CE04分别提升了23.11%和4倍。这一结果显示了基于oPTS1*的双重转运策略在酵母中实现高水平倍增的有效性。

图5 酵母过氧化物酶体和细胞质中α-石竹烯的从头产生

为实现α-石竹烯的高产，将先前改造的细胞质倍半萜生产菌株LW03用作原始菌株，融合PEST序列于LW03的ERG9的C端构建了菌株WCB10，成功使α-石竹烯产量提高至62.86 mg/L（提高了2.96倍）。随后，通过删除GAL80基因并整合tHMG1和HMGR基因，构建菌株LC15，使α-石竹烯的产量提升至104.06 mg/L 。

为能够在过氧化物酶体内合成α-石竹烯，通过将oPTS1*标签附加到8个MVA途径基因及ZSS1基因的C端构建了融合蛋白，并与ScPEX5*共同表达于LC15中，得到 LC16，其α-石竹烯产量达到464.89 mg/L，比母株LC15提高了4.47倍（图5C）。为在过氧化物酶体中提供足够的ATP和NADPH，通过过表达ANT1、IDP2和IDP3至LC16，构建了菌株LC17，从而使α-石竹烯的产量进一步提高至624.87 ± 81.78 mg/L（图5C）。此外，为进一步增加细胞质MVA的产量，研究人员在LC17的rDNA位点上过表达α-石竹烯合成酶基因ZSS1和8个MVA途径基因，最终得到的LC18菌株的α-石竹烯产量提升至1530.15 ± 38.66 mg/L。为进一步评估LC18菌株的性能，研究者在5 L的反应器中进行补料分批发酵，发现当葡萄糖耗尽后进行培养，细胞浓度不断增加，α-石竹烯的积累在细胞生长前的50小时内迅速增长，78小时后达峰值17.33 g/L，但随后逐渐减少。这表明，即使存在降解，研究中仍实现了最高的α-石竹烯生产效率为0.22 g/L/h（表1）。

表1 不同工程微生物生产α-石竹烯