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摘要
2型糖尿病（T2DM）的现代高发及其与共生微生物群的相关性引发了全球对宿主内微生物作用模式的关注。除肠道外，微生物群也在胰腺、口腔和肺部定植，对T2DM的病理生理过程产生影响。本研究旨在探讨黑灵芝多糖（PSG）和白扁豆多糖（WHBP）对T2DM大鼠肠道、胰腺、口腔和肺部微生物群的保护作用。研究结果显示，尽管这两种多糖在T2DM大鼠中对高血糖、血脂异常、胰岛素抵抗和菌群失调均表现出相似的保护作用，但PSG和WHBP各自具有其“靶标”细菌，这可用于多糖种类的活性指纹图谱分析。此外，我们发现胰腺和肺部存在共有的细菌谱，且大多数细菌可在口腔或肠道样本中追踪到。值得注意的是，器官（胰腺、肺部）与唾液之间微生物群特征的重叠部分多于与肠道的重叠部分，这表明唾液样本也可作为判断胰腺损伤的“指示标志”。总体而言，这些微生物群的相互作用为采集替代样本进行疾病监测提供了新的潜力。同时，多糖具有抗T2DM的能力，这可通过其各自的特征性细菌来区分。
1 引言
在特定栖息地中所有微生物（包括原核生物和真核生物的细胞病毒、真细菌和古菌）的集合被称为“微生物群”[1]。微生物群对于维持宿主的生命功能至关重要，这部分功能部分源于它们在婴儿期的行为[2,3]。值得注意的是，微生物群的多样性随着母乳和后续辅食的摄入而增加，并在2岁时趋于稳定，其中大多数微生物群定居于肠道和口腔中[4]。根据组成、位置和背景的不同，微生物群可以是“朋友”，也可以是“敌人”。因此，微生物群异常或失衡在糖尿病的发病机制中起着关键作用，这标志着阐述2型糖尿病（T2DM）新时代的到来[5,6]。
在T2DM中，高脂、高碳水饮食诱导的高血糖会引发肠道和口腔微生物群的明显变化[7]。大量研究表明，不仅在肠道/口腔中，而且在肺部和胰腺中也发现了一些细菌定植，这促进了对不同微生物群之间相互作用的研究[8,9]。肠道和口腔是两个广泛的微生物栖息地，它们之间不仅仅存在相互作用，还与其他微生物群位点有着密不可分的联系。尽管传统上认为某些器官是无菌的，但在胰腺或囊性纤维化等疾病中，尤其检测到肠道微生物在肺部和胰腺中的定植加重[10–12]。成功地改变靶向微生物群显著降低了囊性纤维化患者呼吸功能受损的风险，并增强了胰腺癌患者的抗肿瘤免疫力，这两者都表明了微生物群与宿主之间复杂的相互作用。本研究的关键问题是，暴露于T2DM大鼠的宿主是否与微生物群失调相关，以及口腔、肠道、胰腺和肺部微生物定植模式是否发生变化。
目前，多糖因其参与维持或恢复微生态平衡的益生元特性，已被越来越多地开发为预防糖尿病的健康食品辅料[13,14]。这已成为缓解或预防肠道微生物群相关疾病（如炎症性肠病[15]、肥胖和糖尿病[16]）的一种有前景的方法。多糖是由醛糖或酮糖组成的重要天然聚合物之一，通常被认为是肠道微生物群选择性觅食的营养素，可促进微生物群在肠道中增殖和富集[17]。在我们之前的研究中，黑灵芝多糖（PSG）和白扁豆多糖（WHBP）已被纯化，并分别显示出对T2DM大鼠降血糖和调节糖耐量的健康促进作用，但未进一步讨论其对微生物群的影响[18–20]。在本研究中，选择PSG和WHBP作为实验对象，探讨多糖对2型糖尿病大鼠口腔、肠道、胰腺和肺部微生物群的影响。
2 方法
2.1 实验动物
7周龄雄性Wistar大鼠，体重150–200 g，由中国北京维通利华实验动物技术有限公司提供[证书编号：SCXK（京）2015–0001]。所有涉及动物的程序均符合美国国家卫生研究院（NIH Publications No. 8523, 1996）发布的《实验动物护理和使用指南》。
2.2 试剂
链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；二甲双胍（中美上海施贵宝制药有限公司）；空腹血糖和胰岛素检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；苏木素染料、伊红染料和石蜡（武汉赛维尔生物科技有限公司）；DNeasy PowerSoil Kit（美国Mo Bio/QIAGEN Laboratories）；TreSeq Nano DNA LT Library Prep Kit（美国Illumina公司）；Quant-It PicoGreen dsDNA Assay Kit（美国Invitrogen公司）；AxyPrep DNA Gel Extraction（美国Axygen Scientific Inc.）。
2.3 PSG和WHBP的制备
根据Chen的方法[21]，从中国江西省赣州市的黑灵芝子实体中分离PSG，包括热水提取、离心、浓缩和沉淀。此外，将获得的沉淀物溶于水，通过去蛋白、透析纯化，然后冷冻干燥得到PSG。显示了其分子量和主要特征。PSG的平均分子量（Mw）为1013 kDa，单糖组成为甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖，摩尔比为3.16: 16.17: 3.74: 1.65: 1[22]。
从白洋刀豆（中国安徽省吉顺药材有限公司）中分离WHBP的程序基于热水提取，并额外使用淀粉酶、蛋白酶和蔗糖酶去除多余杂质。随后，应用与PSG纯化相同的技术纯化WHBP。WHBP的理化性质表明，其平均分子量（Mw）为2.3 × 105 Da，组成为葡萄糖、鼠李糖、半乳糖酸、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，摩尔比为23.23: 6.2: 5.09: 2.76: 2.4: 0.48[22]。
2.4 大鼠T2DM模型的建立实验设计
将大鼠随机分为两部分：对照组（命名为Con组）和非对照组。Con组大鼠标准饲养普通饲料，并在指定时间静脉注射（i.v.）等体积的柠檬酸缓冲液。除Con组外，其余大鼠用于建立T2DM模型。通过喂养含40%脂肪、42%碳水化合物和18%蛋白质的高糖高脂饮食8周，然后尾静脉注射30 mg/kg STZ（STZ，溶于0.1 M、pH 4.5的柠檬酸缓冲液中）[23]，建立T2DM动物模型。从第九周开始，通过尾静脉采血，在第1、3、7天测量空腹血糖（FBG），以检查大鼠与T2DM相关的状态。具体地，连续两次血浆葡萄糖水平高于11.1 mmol/L的大鼠被宣布为T2DM大鼠，模型建立成功。从第十周开始，将这些T2DM大鼠随机分为3组，每组6只：（1）模型组（命名为Mod组），由未治疗的糖尿病大鼠组成；（2）模型+PSG组（命名为PSG组）：糖尿病大鼠连续4周通过灌胃给予PSG干预（50 mg/kg）；（3）模型+WHBP组（命名为WHBP组）：糖尿病大鼠连续4周通过灌胃给予WHBP干预（50 mg/kg）。同时，Con组和Mod组接受相同体积的溶剂溶液，并每周测量禁食12小时后的FBG水平。本研究中使用的所有动物均按照美国国家卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》进行饲养，所有程序均在获得南昌大学动物伦理委员会伦理批准后进行。
2.5 样本收集
实验结束时，通过大鼠代谢笼收集新鲜粪便以确定肠道微生物群，并使用无菌棉签拭子收集唾液。随后，在麻醉并处死大鼠后，取出肺部和胰腺样本，用生理盐水洗涤并清除多余脂肪。在采样期间，保持严格的无菌环境，以避免来自实际充满微生物生命的外部环境的交叉污染或微生物群影响。分离部分组织并用10%中性缓冲福尔马林固定后，将剩余部分组织储存在-80°C。同时，分别使用无菌容器收集粪便样本和唾液样本，并立即储存在-80°C直至分析。
2.6 空腹血糖（FBG）和胰岛素抵抗（IR）水平评估
使用罗氏血糖仪测量各组大鼠禁食12小时后的FBG。同时，根据胰岛素试剂盒说明书测量各组大鼠禁食12小时后的胰岛素水平。此外，使用血清胰岛素浓度计算胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）：HOMA-IR = {血清胰岛素（μIU/mL）× FBG（mmol/L）}/22.5。
2.7 生物医学分析
在南昌大学第一附属医院使用自动生化分析仪测量血清中的胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、总高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等生化参数。
2.8 组织形态病理学观察
大鼠解剖后，收集胰腺和肠道组织，用生理盐水洗涤，然后固定在10%中性福尔马林固定液中。通过苏木素和伊红（H&E）染色检查组织的病理形态。该染色方法是用于检查已经固定、处理、包埋和切片的组织显微镜检查的标准。最后，使用光学显微镜观察获得的组织切片以观察组织形态。
图1. 黑灵芝多糖（PSG）和 WHBP 对2型糖尿病（T2DM）大鼠的治疗作用。数据按组别着色（蓝色表示对照组，红色表示模型组，紫色表示PSG组，绿色表示WHBP组），*表示与对照组相比p < 0.05；#表示与模型组相比p < 0.05。（a）多糖对T2DM大鼠空腹血糖（FBG）水平的影响；（b）多糖对T2DM大鼠脂质代谢的影响。TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；（c~d）多糖对T2DM大鼠胰岛素水平和胰岛素抵抗的影响。采用稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）评估胰岛素抵抗；（e）胰腺和肠道的组织学观察。采用苏木精-伊红（H&E）染色法检测组织形态变化，并在光学显微镜下观察组织学变化。细胞核被染成蓝色，细胞质被染成红色，部分细胞质被染成深紫色。（关于本图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版。）
2.9 样本处理与16S rDNA测序
使用Omega DNA试剂盒，根据制造商的说明，从粪便、唾液、肺和胰腺样本中提取微生物DNA。同时，使用Nanodrop（Thermo Scientific）和1.2%琼脂糖凝胶电泳（北京六一）检测DNA提取的数量和质量。随后，使用由上海生工生物工程有限公司（中国上海）提供的上游引物（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和下游引物（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）扩增16S基因的V3-V4区。具体而言，PCR扩增程序包括在98℃下变性2分钟，然后进行30个循环（98℃下15秒，55℃下30秒，72℃下30秒），最后在72℃下延伸5分钟。使用Promega QuantiFluor上的Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒对最终的扩增子文库进行定量，并使用Agilent Bioanalyzer上的Agilent High Sensitivity DNA Kit检测文库质量。合格的PCR产物在上海生工生物工程有限公司（中国上海）的Hiseq2500 PE 250平台上进行测序。
2.10 统计分析
使用SPSS 19.0进行统计分析，数据表示为平均值±标准误（SEM）。对于两组以上的比较，使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey’s多重比较检验。使用Pearson相关分析进行相关性分析。p < 0.05认为具有统计学意义。
3 结果
3.1 PSG和WHBP对2型糖尿病（T2DM）大鼠代谢参数的影响
在模型（Mod）组中，高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）注射导致大鼠空腹血糖（FBG）水平升高，接近30 mmol/L。多糖给药4周后，PSG组和WHBP组的FBG水平较Mod组未治疗的T2DM大鼠显著降低，表明PSG和WHBP能够降低T2DM大鼠的FBG。此外，与对照（Con）组相比，Mod组血清胰岛素水平升高，通过稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）评估的胰岛素抵抗（IR）水平也升高（图1a、c和d）。用PSG或WHBP治疗T2DM大鼠后，与Mod组相比，这些变化显著减少。此外，与Mod组相比，多糖组的HOMA-IR水平也显著降低，表明PSG和WHBP干预阻止了T2DM大鼠的FBG和IR。
T2DM的脂质代谢紊乱通常表现为胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高，以及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）降低。如图1b所示，与Con组相比，Mod组的TC、TG和LDL-C水平显著升高。相反，PSG或WHBP治疗可降低T2DM大鼠的TC、TG和LDL-C水平。同时，结果显示WHBP治疗的大鼠与模型大鼠之间的HDL-C无显著差异。值得注意的是，与Mod组相比，PSG治疗显著提高了T2DM大鼠的HDL-C水平，表明PSG在控制T2DM大鼠脂质代谢方面比WHBP效果更好。综上所述，这些结果表明，口服PSG和WHBP通过改善血糖、血脂和胰岛素抵抗对T2DM具有保护作用。
3.2 PSG和WHBP对T2DM大鼠胰腺组织病理学的影响
Con组胰腺组织的形态和结构完整（图1e），表现为胰岛细胞数量充足且规则。然而，在Mod组中，胰岛细胞变形受损，细胞团块面积不规则并显著缩小，伴随细胞质空泡化增加。与Mod组相比，PSG组和WHBP组胰岛细胞的数量和完整性增加，T2DM大鼠胰腺组织中的细胞空泡化得到改善。胰腺组织的组织病理学检查显示，Mod组出现的组织病理学变化可通过PSG和WHBP治疗得到修复，支持了这些多糖在T2DM大鼠胰腺组织中发挥有益作用的假设。
3.3 PSG和WHBP对T2DM大鼠肠道组织病理学的影响
在本研究中，Con组大鼠空肠黏膜的上皮细胞排列紧密，无病理症状（图1e）。然而，Mod组T2DM大鼠的形态结构严重受损，绒毛上皮断裂，隐窝深度显著降低。与Mod组相比，PSG组和WHBP组空肠组织的形态显著改善，绒毛增加，肿胀程度和炎性细胞浸润减少。结果表明，PSG和WHBP对抑制T2DM大鼠肠道组织的组织病理学变化具有保护作用。
3.4 PSG和WHBP对T2DM大鼠口腔、肠道、胰腺和肺部微生物群的影响
3.4.1 PSG和WHBP对T2DM大鼠肠道微生物群的影响
在本研究的所有样本中共发现了20931个扩增子序列变异体（ASV），并筛选出327个为所有组共有的ASV（图2a）。物种多样性差异显示，Mod组的Chao1和Shannon指数升高，表明T2DM大鼠的微生物群更丰富且更多样化（图2b~c）。此外，β多样性测量结果显示，Mod组T2DM大鼠肠道微生物群的失衡与肠道损伤相关（图2d）。此处的主坐标分析（PCoA）图显示，Con组健康大鼠的聚类分布比Mod组T2DM大鼠的聚类分布更紧密，两者之间存在显著差异。这暗示T2DM导致大鼠肠道微生物群混乱。与Mod组相比，PSG或WHBP缩短了T2DM诱导的微生物群聚类分布距离，伴随着向Con组微生物群特征的适度转变和接近。这些结果表明，通过α和β多样性测量，PSG和WHBP可以改善T2DM引起的肠道微生物群变化。
在我们的样本中，厚壁菌门（Firmicutes）在数量上占主导地位，其在Con组中的平均相对丰度为93.9%，在Mod组中为55.6%。除了厚壁菌门，拟杆菌门（Bacteroidetes）在Mod组中高度富集，相对丰度为38.2%。口服PSG和WHBP有助于改善T2DM大鼠中厚壁菌门的减少和拟杆菌门的增加（图2e）。随后，分析了肠道微生物群在属水平上的变化，并确定Con组中数量占主导地位的细菌是乳杆菌属（Lactobacillus，71.3%），而Mod组中是普氏菌属（Prevotella，18.53%）。显然，与Con组相比，Mod组中乳杆菌属的数量显著减少。相应地，WHBP和PSG显著降低了普氏菌属的相对丰度，同时增加了T2DM大鼠中的乳杆菌属（图2f）。我们的结果表明，PSG和WHBP的管理在T2DM大鼠中改变了微生物群失调，使其在门水平和属水平上都恢复为健康的肠道微生物群组成。
此外，宏基因组测序（metagenomeSeq）分析提供了肠道微生物群中显著不同的特征，这些差异来自四组之间的配对比较。在本研究中，T2DM的微生物群富集了拟杆菌门（普氏菌属）和厚壁菌门（Turicibacter属、Blautia属、梭菌属、Allobaculum属）。同时，与Con组健康大鼠相比，Mod组T2DM大鼠中的厚壁菌门（乳杆菌属、粪球菌属、瘤胃球菌属、Phascolarctobacterium属和Oscillospira属）观察到下调（图2g）。与Mod组相比，PSG和WHBP均可下调普氏菌属、Blautia属，并上调乳杆菌属、Oscillospira属以及粪球菌属、瘤胃球菌属（图2h~i）。此外，PSG和WHBP对肠道微生物群的调节作用与其在T2DM大鼠中微生物调节的各自特征相关。简而言之，PSG治疗抑制了链球菌属、梭菌属的生长，而WHBP可增加T2DM大鼠中罗斯氏菌属的相对丰度，并减少Turicibacter属和拟杆菌属。
图2. 黑灵芝多糖（PSG）和白扁豆多糖（WHBP）对2型糖尿病（T2DM）大鼠肠道微生物群的影响。（a）肠道微生物群的种类。扩增子序列变异（ASV）被分类为界、门、纲、目、科、属和种；（b~c）肠道微生物群的Alpha多样性。采用Chao1和Shannon指数评估大鼠肠道微生物群的Alpha多样性。（d）肠道微生物群的Beta多样性。采用主成分坐标分析（PCoA）评估Beta多样性，使用未加权的UniFrac距离。在此图中，绿色表示对照组（Con），紫色表示模型组（Mod），橙色表示黑灵芝多糖组（PSG），蓝色表示茯白扁豆多糖（WHBP）；（e）门水平上的肠道微生物群注释结果；（f）属水平上的肠道微生物群注释结果；（g）与对照组相比，模型组富集的核心微生物。使用MetagenomeSeq分析组间差异；（h）与模型组相比，黑灵芝多糖组富集的核心微生物；（i）与模型组相比，白扁豆多糖组富集的核心微生物。（关于本图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版。）
3.4.2. 2型糖尿病（T2DM）患者的唾液微生物群
通过与唾液中的Greengenes数据库比对，在所有组的唾液微生物群中总共观察到了9396个扩增子序列变异（ASV）（图3a）。对群落组成、多样性和丰度的初步研究表明，模型组（Mod）大鼠的唾液微生物群与对照组（Con）相比存在显著差异（图3b~i）。与模型组相比，口服黑灵芝多糖（PSG）或白扁豆多糖（WHBP）表现出缓解上述唾液微生物群结构紊乱的能力。具体而言，与对照组相比，Chao1分析结果显示模型组显著增加，而黑灵芝多糖组或白扁豆多糖组则无显著性差异，表明未治疗的2型糖尿病大鼠拥有比其他任何组都更丰富的微生物群（图3b）。随后，Shannon分析的结果表明，各组之间无差异（图3c）。此外，对照组和模型组的微生物群落存在显著差异，且各自聚集。在主坐标分析（PcoA）散点图（图3d）中，尽管多糖处理组的微生物群特征与对照组的距离仍然较远，但黑灵芝多糖或白扁豆多糖治疗2型糖尿病大鼠可缓解模型组中分散的微生物群数据，使其在微生物群特征上更加凝聚。我们的研究结果表明，多糖黑灵芝多糖和白扁豆多糖可在唾液中形成更稳定的微生物群落。
接着，我们检查了唾液中门水平和属水平的细菌组成（图3d和e）。在门水平，发现变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门是唾液中的核心微生物群。变形菌门在对照组健康大鼠中占据绝对优势，平均相对丰度约为78%，而在2型糖尿病大鼠的模型组中显著降低。同时，与对照组相比，模型组中厚壁菌门和放线菌门有所增加（图3d）。接下来，我们在属水平检查了微生物群组成的细微变化。我们的数据显示，基于平均相对丰度筛选出了前20种细菌，其中聚集杆菌属、巴斯德氏菌科和链球菌属是优势微生物群（图3e）。因此，我们采用metagenomeSeq分析，通过配对比较来揭示微生物的差异。在模型组中，放线菌门（放线菌目）、厚壁菌门（芽孢杆菌目、梭菌目、乳杆菌目）和变形菌门（肠杆菌目、巴斯德氏菌目、假单胞菌目）与对照组相比具有显著性（图3g）。数据表明，乳杆菌目、肠杆菌目、巴斯德氏菌目和假单胞菌目的丰度在模型组的唾液中明显不同且有所增加（图3g和f）。这些差异因黑灵芝多糖和白扁豆多糖的干预而减弱，乳杆菌目被确定为黑灵芝多糖和白扁豆多糖的核心和重叠微生物群。同时，放线菌目可被白扁豆多糖改变，而假单胞菌目可被黑灵芝多糖改变（图3h~i），这表明这两种多糖在唾液微生物群中发挥了其特有的调节作用。
3.4.3. 2型糖尿病患者的胰腺微生物群
总共计数了5281个ASV（图4a），模型组中的ASV数量高于对照组、黑灵芝多糖组或白扁豆多糖组。Chao1和Shannon指数表明，未治疗的2型糖尿病大鼠拥有高水平的微生物群丰富度和多样性（图4b~c）。PCoA分析显示，模型组与对照组的胰腺微生物群特征存在显著差异（图4d）。经黑灵芝多糖或白扁豆多糖治疗后，其各组与对照组的距离与模型组相比显著缩短，表明它们更接近对照组。因此，我们的多糖可以恢复2型糖尿病大鼠胰腺中的微生物群落。
随后，在所有组的门水平上发现变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门是优势细菌（图4e）。除对照组外，我们发现暴露于2型糖尿病的每只大鼠中栖热菌门的丰度均显著减少。与对照组相比，模型组中拟杆菌门和厚壁菌门的丰度较高，而变形菌门的丰度降低。同时，黑灵芝多糖和白扁豆多糖的干预可通过在门水平上增加变形菌门和减少拟杆菌门及厚壁菌门来防止2型糖尿病大鼠发生菌群失调。在属水平上，铜绿假单胞菌属和不动杆菌属不仅在对照组中占据优势，在模型组中也同样占据优势（图4f）。与对照组相比，模型组中不动杆菌属的相对丰度显著降低，且经黑灵芝多糖和白扁豆多糖治疗后，这种降低趋势可进一步加剧。
此外，metagenomeSeq分析表明，与对照组相比，模型组中厚壁菌门（乳杆菌目、梭菌目）和变形菌门（肠杆菌目、交替单胞菌目）显著增强（图4g）。与模型组相比，黑灵芝多糖治疗可增加交替单胞菌目、假单胞菌目、鞘脂单胞菌目和支原体目的丰度（图4h）。与黑灵芝多糖治疗的结果不同，白扁豆多糖可显著降低梭菌目的丰度，并增加芽孢杆菌目、乳杆菌目和丹毒丝菌目的丰度（图4i）。例如，已有研究表明梭菌类与Treg细胞群相关，可通过产生短链脂肪酸导致胰腺炎，这表明白扁豆多糖可通过调节2型糖尿病大鼠中的梭菌目来恢复免疫反应的健康控制[24]。这些发现表明，我们的多糖在2型糖尿病大鼠的微生物群调节中表现出差异选择作用。
随后，我们研究了微生物群落变化与胰腺损伤之间的相关性，这是与2型糖尿病发病机制（如胰岛素抵抗）相关的关键因素。具体而言，我们采用皮尔逊积差相关系数（PCCs）来阐明胰岛素抵抗与细菌之间的关系。结果表明，属水平上的S24-7和种水平上的苍白杆菌属、瘤胃球菌属的高丰度与胰岛素抵抗风险增加平行，相关系数分别为0.95、0.98和0.97。相反，变形菌门和沉积物杆菌属、鞘脂单胞菌属、土壤杆菌属和假单胞菌属的高丰度大鼠表现出低水平的胰岛素抵抗，相关系数分别为0.94、0.92、0.62、0.93和0.93。根据现有结果，与对照组相比，黑灵芝多糖和白扁豆多糖可提高变形菌门的水平，同时降低胰岛素抵抗。此外，数据还显示，鞘脂单胞菌属和假单胞菌属在黑灵芝多糖组中表现出高水平。综上所述，我们的研究证明了2型糖尿病胰腺损伤与其微生物群之间的联系，这涉及黑灵芝多糖和白扁豆多糖的抗糖尿病作用机制。
3.4.4. 2型糖尿病患者的肺部微生物群
肺部总共2315个ASV（5a）的数量远少于肠道、唾液或胰腺。基于未加权的UniFrac距离的Chao1指数、Shannon指数和PcoA分析对肺部微生物群群落进行了初步分析（图5bf）。结果表明，与对照组相比，模型组的Chao1和Shannon指数有下降趋势（图5bc）。在PCoA图中，2型糖尿病个体间显示为不规则分布的散点，其微生物群特征在模型组中与对照组的健康微生物群相距甚远（图5d）。黑灵芝多糖和白扁豆多糖可通过提高丰富度和多样性、调节2型糖尿病大鼠肺部微生物群的结构，显著抑制由2型糖尿病诱导的变化，并接近对照组。然后，进一步评估了肺部三种优势门，包括变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门。
在门水平上，所有组肺部微生物群的组成均未检测到显著变化。值得注意的是，本研究中一个意外的发现是，除对照组健康大鼠外，2型糖尿病大鼠中普遍存在门水平的芽单胞菌门（图5e）。所得结果表明，由于芽单胞菌门在所有样本的肠道、胰腺和唾液中均普遍存在，因此它可能是2型糖尿病大鼠肺部的一种典型细菌。此外，它还可以被我们的多糖调节，经黑灵芝多糖或白扁豆多糖治疗后显著减少。在属水平上，发现不动杆菌属和铜绿假单胞菌属高度占优，平均相对丰度分别为21.8%和21.7%（图5f）。
metagenomeSeq分析表明，通过对照组与模型组、黑灵芝多糖组与模型组或白扁豆多糖组与模型组的配对比较，几乎无法分离出具有显著差异的细菌。因此，我们通过分析前20种细菌来确认差异，结果表明，不动杆菌属、[栖热菌门]、厚壁菌门和铜绿假单胞菌属、不动杆菌属、沉积物杆菌属、细链菌属、苍白杆菌属、鞘脂单胞菌科、线粒体属在各组之间均存在差异。上述细菌的丰度可通过多糖给药来塑造，从而达到对照组健康微生物群的状态，这表明黑灵芝多糖和白扁豆多糖可以作为其“目标”细菌的选择性富集的营养底物。
图3. 黑灵芝多糖（PSG）和白扁豆多糖（WHBP）对2型糖尿病（T2DM）大鼠口腔微生物群的影响。（a）口腔微生物群的物种分类。扩增子序列变异体（ASV）被分类为界、门、纲、目、科、属和种；（b~c）口腔微生物群的Alpha多样性。采用Chao1和Shannon指数评估大鼠肠道微生物群的Alpha多样性；（d）口腔微生物群的Beta多样性。采用主成分坐标分析（PCoA）评估Beta多样性，使用未加权的UniFrac距离。在此图中，绿色表示对照组（Con），紫色表示模型组（Mod），橙色表示黑灵芝多糖组（PSG），蓝色表示怀特白扁豆多糖（WHBP）；（e）门水平上的口腔微生物群注释结果；（f）属水平上的口腔微生物群注释结果；（g）与对照组相比，模型组富集的核心微生物。使用MetagenomeSeq分析组间差异；（h）与模型组相比，黑灵芝多糖组富集的核心微生物；（i）与模型组相比，怀特黑藜芦根提取物组富集的核心微生物。（关于本图例中颜色引用的解释，请参阅本文的网络版。）
图4. 黑灵芝多糖（PSG）和白扁豆多糖（WHBP）对2型糖尿病（T2DM）大鼠胰腺微生物群的影响。（a）胰腺微生物群的物种分类。扩增子序列变异体（ASV）被分类为界、门、纲、目、科、属和种；（b~c）胰腺微生物群的Alpha多样性。采用Chao1和Shannon指数评估大鼠肠道微生物群的Alpha多样性；（d）胰腺微生物群的Beta多样性。采用主成分坐标分析（PCoA）评估Beta多样性，使用未加权的UniFrac距离。在此图中，绿色表示对照组（Con），紫色表示模型组（Mod），橙色表示黑灵芝多糖组（PSG），蓝色表示白扁豆多糖组（WHBP）；（e）门水平上的胰腺微生物群注释结果；（f）属水平上的胰腺微生物群注释结果；（g）与对照组相比，模型组富集的核心微生物。使用metagenomeSeq分析组间差异；（h）与模型组相比，黑灵芝多糖组富集的核心微生物；（i）与模型组相比，怀特黑藜芦根提取物组富集的核心微生物。（关于本图例中颜色引用的解释，请参阅本文的网络版。）
图5. 黑灵芝多糖（PSG）和白扁豆多糖（WHBP）对2型糖尿病（T2DM）大鼠肺部微生物群的影响。（a）肺部微生物群的物种分类。扩增子序列变异体（ASV）被分类为界、门、纲、目、科、属和种；（b~c）肺部微生物群的Alpha多样性。采用Chao1和Shannon指数评估大鼠肺部微生物群的Alpha多样性；（d）肺部微生物群的Beta多样性。采用主成分坐标分析（PCoA）评估Beta多样性，使用未加权的UniFrac距离。在此图中，绿色表示对照组（Con），紫色表示模型组（Mod），橙色表示黑灵芝多糖组（PSG），蓝色表示白扁豆多糖（WHBP）；（e）门水平上的肺部微生物群注释结果；（f）属水平上的肺部微生物群注释结果。（关于本图例中颜色引用的解释，请参阅本文的网络版。）
图6. 2型糖尿病（T2DM）大鼠口腔、肠道、胰腺和肺部微生物群的交互作用分析。（a）一个包含本研究中获得的口腔、肠道、胰腺和肺部微生物群的维恩图，显示了四个部位之间独特和共有的扩增子序列变异体（ASV）数量；（b~c）通过以列形式展示的维恩图来解释ASV的分布。分别在门和属水平的分类群中展示了所有样本中平均序列丰度最高的前10种细菌。
3.5. 宿主微生物群的交互作用
在本研究中，我们分别在门水平和属水平上比较了四种组织（肠道、唾液、胰腺和肺部）中的微生物群。令人惊讶的是，我们发现胰腺和肺部之间存在相似性，包括物种多样性和微生物群落结构（图6a~c）。特别是，它们共有的门主要由变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门主导，这表明胰腺和肺部可能具有相似的定植模式。我们还发现，上述组织（胰腺、肺部）与唾液中的微生物群重叠区域多于肠道，这表明与肠道中的微生物群相比，唾液中的微生物群与胰腺和肺部共有的微生物群之间的相互作用更为密切。随后，我们分别在口腔和肠道中一对一匹配了细菌（基于它们在胰腺和肺部中的相对丰度筛选出前30种细菌）。确实，大多数细菌在口腔和肠道中均可追溯到，其中几种仅在口腔中检测到，如门水平的阿米特菌门、绿菌门、纤维杆菌门、OD1、OP11、浮霉菌门、互养菌门，以及属水平的细弱螺旋体属、线粒体。此外，胰腺和肺部中属水平上前30种细菌的丰度与肠道微生物群（以超过70%的相对丰度由乳杆菌属主导）的丰度几乎不匹配，但与唾液微生物群相似，这表明胰腺和肺部的微生物主要来自口腔而非肠道。同时，本研究并未否定“肠道微生物群到器官”轴的存在，这可能是由于动物模型的局限性以及对细菌代谢产物研究的缺乏所致。因此，这些器官之间共有微生物群所涉及的轴仍值得进一步探索。总体而言，肺部与胰腺一样，历史上一直被视为“无菌环境”。我们的研究结果表明，存在从肠道/口腔微生物群向器官（胰腺和肺部）无菌环境的定植转移，且口腔微生物群与它们的定植关系更为密切。
3.6. 共有细菌谱
众多研究表明，在囊性纤维化肺病和胰腺癌的影响下，胰腺和肺部的微生物入侵和变化有所增加[25]。在本研究中，我们列出了口腔、胰腺和肺部中最丰富的12种共有微生物群，以及在糖尿病暴露后的特征性变化，如表1所示。在此，我们提出一个假设，即微生物变化具有作为胰腺/肺部疾病爆发前的“预示性”变化的能力，这将为临床医学诊断和预测提供一个引人入胜的领域。在临床环境中，直接收集胰腺/肺部样本很困难，但从唾液和粪便中获取微生物群则更为可行。根据本研究的结果，通过分析唾液微生物结构来了解胰腺/肺部的微生物群状态可能是一种替代指标。在本研究中，我们展示了口腔、胰腺和肺部中的共有微生物群，以及在糖尿病暴露后的特征性变化，如表1所示。
3.7. 2型糖尿病大鼠中的细菌比例
随后，基于以往研究，我们选择了具有显著意义的细菌比例（参考值），以揭示宿主微生物群如何影响疾病。尽管肠道微生物群的组成存在个体差异，但在门水平（如微生物种类）上观察到了一种相对稳定的状态。具体而言，通过比较每种物种的丰度可以明显区分差异。一项关于人类成人（包括18名2型糖尿病患者和18名非糖尿病患者）肠道微生物群的研究表明，门水平的厚壁菌门与拟杆菌门的比例（F/B）以及属水平的拟杆菌属与普氏菌属的比例（B/P）与血浆葡萄糖水平显著相关[26,27]。因此，这两个比例被证实为糖尿病的特有指标。与以往研究[26]一致，我们在研究中发现糖尿病肠道微生物群中的F/B和B/P比例均有所下降，并且与血浆葡萄糖浓度显著相关，相关系数分别为0.91和0.96（表2）。在胰腺中，我们也观察到了与血浆葡萄糖浓度显著相关的F/B比例变化。此外，在口腔微生物群（0.91）和肺部微生物群（0.81）中，门水平的变形菌门与厚壁菌门的比例（P/F）而非F/B和B/P与血浆葡萄糖浓度呈高度显著的负相关。总体而言，我们的数据表明，肠道和胰腺中的F/B比例，以及口腔和肺部中的P/F比例，可作为反映2型糖尿病患者血浆葡萄糖变化的“预示性”指标。
上述结果表明，2型糖尿病（T2DM）大鼠的微生物群组成与健康大鼠不同，并表现出微生物群紊乱的特征。高热量/高脂肪饮食是导致微生物群紊乱的“主要推动力”，可促进肥胖、T2DM前期和T2DM的发生[26]。相应地，通过制定补充益生菌的饮食模式，可以利用细菌的益处作用来恢复微生物群群落[28,29]。多项研究表明，增加天然多糖的摄入可通过选择性调节肠道细菌丰度，在T2DM预防方面起到“有益”作用[30]。黑灵芝多糖（PSG）和白扁豆多糖（WHBP）是从天然食材中纯化得到的水溶性多糖，可显著纠正T2DM大鼠引起的肠道微生物群紊乱。此外，唾液、胰腺和肺部细菌（见3.9.3）的变化也得到了改善，表明多糖也可减轻这些部位的结构紊乱。这些发现提供了直接证据，表明多糖作为条件剂的益生菌作用不仅限于肠道微生物群，还对口腔、胰腺和肺部的微生物群产生积极影响。此外，PSG和WHBP可促进乳酸杆菌属、颤螺菌属、普雷沃菌属、布劳特氏菌属、粪球菌属和瘤胃球菌属的生长，并有助于恢复健康状态。尽管在给予PSG或WHBP的T2DM大鼠中，微生物群的作用可能来自相同的细菌，但在PSG组和WHBP组中也发现了与微生物群调节相关的不同细菌。例如，PSG治疗可促进口腔、胰腺、肺部假单胞菌属的生长，并降低瘤胃球菌属的相对丰度，而WHBP则修改了罗氏菌属、放线菌属、芽孢杆菌属的相对丰度。值得注意的是，这些结果表明PSG和WHBP在糖尿病预防方面具有各自独特的活性特征。尽管本研究表明PSG和WHBP在T2DM大鼠中对不同细菌具有微生物保护作用，但其潜在机制尚未完全阐明。
4 讨论
在本研究中，我们证实了黑灵芝多糖（PSG）和白扁豆多糖（WHBP）对T2DM大鼠的抗糖尿病和宿主微生物调节作用。具体而言，我们的结果表明，PSG和WHBP可显著抑制高血糖并减轻胰岛素抵抗（IR），同时对T2DM大鼠的微生物群具有有益调节作用。
作为一种水溶性膳食成分，PSG降低血糖和血清脂质的功能已得到广泛认可[18]，本研究也验证了这一点。相比之下，WHBP对糖尿病的生物化学和微生物学影响尚不清楚。尽管Suh已证明白扁豆提取物可通过抑制肝脏脂质摄取和肝细胞脂滴积聚，对高脂肪饮食诱导的体重增加、体脂量增加和脂肪肝病具有保护作用[19]。但本研究结果清楚地表明，PSG和WHBP可显著抑制T2DM引起的高血糖并减轻胰岛素抵抗，这可能与其在微生物群调节中的益生菌作用有关。
已有研究表明，微生物群对人类健康有深远影响，人类微生物群的异常有助于某些流行病的发展。越来越多的证据表明，微生物群失衡与T2DM的发生和发展有关。近年来，众多研究聚焦于肠道微生物群，已有证据支持PSG对T2DM的保护作用至少部分归因于对肠道微生物群及其代谢物的调控。除肠道微生物群外，唾液中还有人类微生物群的另一个重要组成部分，人类每天分泌的唾液量约为1~1.5升[31]。尽管已有研究表明唾液微生物群与T2DM的进展有关，但关于其在T2DM状态的动物和人体模型中是否受多糖影响，目前尚知之甚少。同时，随着基于遗传-宏基因组学研究的测序技术的进步，胰腺和肺部微生物群已被鉴定并受到广泛关注，这挑战了胰腺和肺部在健康状态下为无菌的旧有观念。因此，我们在T2DM的背景下研究了口腔、肠道、胰腺和肺部微生物群以及它们之间的相互关系。微生物群研究产生的数据发现了上述器官中具有生物学相关性的失衡。特别是，T2DM大鼠的肠道微生物受到了最严重的损害。PSG和WHBP可通过调节微生物群落的丰度和多样性来显著抑制菌群失调。相应地，我们的黑灵芝多糖PSG和WHBP得到了深入研究，并在T2DM大鼠的肠道微生物群中发挥了有益作用。此外，PSG和WHBP对肠道微生物的保护作用与其使肠道形态正常化的能力有关。肠道中的微生物众多，它们组成了一个生物生态系统，通过与宿主沟通来选择性地利用营养物质或间接分泌代谢产物来操纵人类共生功能。有趣的是，结果表明，在T2DM预防方面，PSG和WHBP的饮食给药具有相似的生物化学特性模式，但它们对微生物群的调控并不完全一致。一致的是，数据显示，普雷沃菌属、乳酸菌属、乳杆菌属、颤螺菌属、粪球菌属和瘤胃球菌属受PSG和WHBP的显著调控。近期研究表明，乳酸菌属、颤螺菌属的低水平与体重指数（BMI）和内脏肥胖相关[32]，这表明乳酸菌属和颤螺菌属的增加在PSG和WHBP的糖尿病预防中发挥作用。
独特的是，PSG抑制了链球菌属、梭菌属的生长，而WHBP则选择性调节了T2DM大鼠中罗氏菌属、Turicibacter属和拟杆菌属的丰度。鉴于普雷沃菌属和布劳特氏菌属与葡萄糖代谢受损、高血压和T2DM密切相关[33-35]，我们的结果表明，对普雷沃菌属和布劳特氏菌属的影响直接参与了WHBP的糖尿病预防。因此，基于PSG和WHBP分别识别的“目标”细菌，多糖在组成和结构上的个体特征应对这些差异负责。
迄今为止，几项研究已揭示胰腺中也存在微生物群，这些微生物群受胰腺β细胞产生的抗菌物质控制，其外分泌失衡与糖尿病（DM）相关[36]。实际上，微生物群的生物生态系统不仅存在于肠道中，还存在于其他器官，如胰腺、口腔和肺部。新兴研究强调，多个身体部位之间存在微生物群交互作用，从而影响疾病的发病机制[37]。在过去十年中，已注意到四个栖息地之间的微生物群对话可促进炎症性肠病[38]、结直肠癌[39]、糖尿病[40]和胰腺癌[41]的发生和发展。随后，我们还分析了唾液微生物群、胰腺微生物群和肺部微生物群，结果表明，PSG或WHBP治疗可减轻T2DM大鼠中这些器官由糖尿病引起的失衡。具体而言，乳酸杆菌属在每个部位均有发现且占主导地位，PSG和WHBP均可显著改变其状态。已证明乳酸杆菌属可减轻T2DM，并通过抑制脂多糖（LPS）分泌和激活GPR43途径在胰岛素信号和肠道稳态中发挥关键作用[42]。同时，胰腺和肺部中的鞘脂单胞菌属也受PSG的调控。此外，除肠道外，PSG在T2DM大鼠的口腔、胰腺和肺部对假单胞菌属的独特管理显示出与胰岛素抵抗（IR）水平显著负相关。已有研究提出，血源性和肠内途径是口腔细菌形成异位定植的两种可能途径[39]。通常，肺部与胰腺一样，历来被认为是“无菌环境”。虽然胰腺微生物群和肺部微生物群的来源仍存在争议，但口腔、菌群或咽喉部的微生物群被认为是定植来源。此外，据报道，肠道微生物群通过“肠-肺”或“肠-胰腺”轴成为另一贡献者[41,43,44]。
不可否认的是，内部器官（如胰腺和肺部）的样本收集很困难，需要严格的临床诊断技术。而粪便和唾液作为最常用的样本，在临床环境中易于采集。令人鼓舞的是，我们总结了肠道、口腔、胰腺和肺部微生物群之间的联系。伴随着一个显著特征，即主要细菌对T2DM病理变化的反应性，这表明粪便和唾液可能是克服胰腺和肺部组织样本采集困难的替代样本。此外，我们在本研究中提出的比例表明，厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）、拟杆菌属/普雷沃菌属（B/P）、厚壁菌门/拟杆菌属（F/B）和普雷沃菌属/厚壁菌门（P/F）的显著变化与血浆葡萄糖水平相关。微生物群失衡被认为早于临床特征出现，我们的研究结果强调，唾液中的微生物群似乎有望成为监测糖尿病发病和进展的理想样本[45]。此外，与健康大鼠相比，T2DM大鼠口腔、肠道、胰腺和肺部中的两种细菌（梭菌属和乳酸杆菌属）表现出显著变化。而且，来自唾液和胰腺的共生细菌梭菌目属的相对丰度较低，其变化与T2DM糖尿病的特征呈正相关。相应地，经PSG和WHBP治疗后，梭菌目属的变化可得到改善。因此，这些发现表明，微生物群交互作用为收集疾病监测的替代样本（唾液微生物群）提供了新的潜力，同时多糖通过塑造代谢交互作用具有抗糖尿病能力。
5 结论
综上所述，本研究主要有三大发现：（1）PSG和WHBP在T2DM预防中的有益作用具有各自独特的活性特征；（2）本研究报道了PSG和WHBP对口腔、肠道、胰腺和肺部微生物群的改善功能；（3）微生物群交互作用支持口腔微生物群可作为指导临床评估肺部和胰腺的有价值证据。我们的数据需要在T2DM的流行病学调查和进一步的动物实验中得到验证和加强，以使研究结果具有普遍性。
