微生物间经常相互竞争，但也可以相互作用，形成合作网络，获得适应性优势。无论是竞争还是合作，微生物的密切接近都会改变细胞外代谢物的环境，导致细胞间代谢物的交换。无论是在细胞内还是在细胞之间进行代谢的能力，都可以赋予细胞更强的代谢能力，增加其对波动环境的适应潜力，赋予压力抗性。这种相互作用的一个重要机制是强制性协同作用，即两个或两个以上的生物体通过相互吸食对方的代谢产物而存活下来的一种相互关系。当附近的微生物具有互补的代谢缺陷时，可以形成交叉喂养，其中每个菌株的外代谢组提供其邻近菌株所需的代谢物。
然而，建立这种稳定的种内或种间相互作用并非易事。过去已经探索了多种加强营养缺陷型生物之间代谢合作的实验策略。这些包括使营养缺陷型生物具有抗反馈性，从而将它们转化为代谢物的过度生产者，并改善互补营养型对的生长，否则这些营养型对不会共养。这种合成群落促进了生物合成模块在时间或空间上的分离。越来越多的证据表明，酿酒酵母具有足够的生物合成和代谢物运输能力，可以通过共生相互作用来弥补代谢缺陷，因此假设酵母中可能存在一些营养缺陷对，可以自发地克服建立可持续群落的挑战。因此设计了一个基因组规模的高通量筛选，以测试单倍体酵母基因敲除(YKO)的原生营养版本的营养缺陷细胞的二元组合在合成最小(SM)培养基上表现出共生生长的能力。
少数酿酒酵母营养缺陷型菌对可以形成共养群落
为了鉴定营养缺陷型，使用了由5,185个含有pHLUM小染色体的敲除突变体组成酿酒酵母基因缺失文库来补充四种缺陷型(his3∆、leu2∆、met15∆和ura3∆)，并比较BY4741菌株在营养补充的合成完全培养基(SC)和缺乏氨基酸和核苷酸补充的合成最小培养基(SM)的生长。92株菌株在SM中培养18 h后生长较差，但在SC中生长良好。其中73%的菌株含有直接涉及氨基酸或核苷酸生物合成途径的基因缺失。
为了测试这些营养缺陷型菌株是否可以与互补菌株形成共养群落，通过自动菌落采集和液体处理机器人，以高通量的方式将每一个营养缺陷型菌株与液体SM培养基中的其他91个菌株接种。测试的1,891对营养缺陷型对中的1,842对无法在SM中生长。发现36个独特的营养缺陷型菌对比每个相应的营养缺陷型细胞生长得好得多。89%的营养缺陷菌仅与以下9条代谢途径的缺失相关：蛋氨酸和有机硫循环、组氨酸、色氨酸、精氨酸、腺嘌呤、赖氨酸、尿嘧啶、异亮氨酸/缬氨酸和芳香族氨基酸超通路。
图1 高通量生长互补筛选概述
共生共培养的生长动力学特征
用荧光蛋白标记每对中的营养缺陷型菌株，表征9个经验证的共培养菌的种群动态和相互作用，然后使用分光光度计和荧光显微镜的荧光读数估计混合种群随时间的比例。合养酵母群体的培养成功对种群密度和比例很敏感。接种比例的变化对滞后期的持续时间和最大生长都有相当大的影响。各菌群的最佳接种比均为滞后期最短、生长最大值最高，说明共生营养菌群在进入指数生长前需要满足特定的胞外条件。延长的滞后期可能对应于所需的“问候”期，在此期间，共生种群中互补的营养缺陷型细胞必须相互适应其代谢网络，以使每个营养缺陷型细胞的供应输出满足其伙伴的进口需求。种群分析揭示了不同共培养物的生长模式，大致可分为以下两类：两种菌株的生长均衡(如met14Δ-trp4Δ和met14Δ-arg2Δ)，以及一种菌株的明显优势(如met14Δ-met5Δ和trp2Δ-trp4Δ)。所测试的共培养物的不同动态可归因于多种因素，例如共享代谢物的扩散速度和每种营养缺陷型菌株维持生长所需的代谢物的流入速度。各种种群比例可以支持群落生长的事实表明，共生关系是一种灵活的、紧急的机制，可以适应相关菌株代谢能力的要求。
图2 表征三种重组的共养酵母共培养物随时间变化的生长行为
TRP2∆–TRP4∆交换产物和终产物
共生群落生物技术的主要潜力是在多个细胞之间分摊生物合成途径的代谢负担。这通常不需要交换途径的最终产物，而是交换中间产物。代谢途径的结构表明，trp2∆和trp4∆菌株必须共享至少一种生物合成中间体，而不是一个无机离子，最有可能是邻氨基苯甲酸酯，它是Trp2p的产物和Trp4p的底物，此外还有最终产物色氨酸或邻氨基苯甲酸酯和色氨酸之间的四种中间体之一。由于三种中间代谢物不稳定，磷酸化代谢物不太可能为了轻易穿过细胞膜，因此只定量测定了邻氨基苯甲酸酯、吲哚和色氨酸。检测到在SM的trp2∆-trp4∆群落以及SM中添加色氨酸(SM+tryp)的trp4∆群落的胞外邻氨基苯甲酸浓度大幅增加，但在WT或trp2∆中未检测到邻氨基苯甲酸。邻氨基苯甲酸胞外浓度与trp4∆的接种量成正比。色氨酸的模式略有不同，以1:2的比例接种的trp2∆-trp4∆群落显示出最大的胞外色氨酸浓度。在WT和任何共培养物之间没有观察到吲哚浓度的显著差异。
将trp2∆和trp4∆细胞接种在添加了邻氨基苯甲酸的SM中。与假设一致，在SM培养基中添加邻氨基苯甲酸盐可以恢复trp2∆的生长，但不能恢复trp4∆的生长，而添加色氨酸可以恢复两种菌株的生长。最后，正如预期的那样，由于吲哚位于Trp2p和Trp4p催化反应的下游，在SM中添加吲哚可以部分恢复 和trp4∆的生长。这些观察结果表明，这种共培养物交换邻氨基苯甲酸盐和色氨酸或吲哚，或两者兼而有之。
图3 表征 trp2∆–trp4∆ 共养群落
分工增加MSA产量
研究中发现并验证的共培养提供了一个稳定的、自发建立的系统，接下来测试了代谢劳动的分工是否会提高代谢途径的效率。选择提高MSA的生产作为试例，MSA的合成包括以下两个核心酶：来自Tribolium castaneum的天冬氨酸-1-脱羧酶(TcPAND，由LOC100124592基因编码)和来自Bacillus cereus的β-丙氨酸-丙酮酸氨基转移酶(BcBAPAT，由yhxA 基因编码)。首先测试了非共养与单一共养的分工情况，观察到，单培养的OD600较低，这表明在同一细胞中表达这两种基因的代谢负担较高。但是，在单一栽培中，MSA的产量也更高，这表明碳源更好地转化为产物。这些结果表明，劳动分工可能会减轻代谢负担，但这并不足以在非共生情况下提高产量。
接下来，将编码TcPAND和BcBAPAT的基因克隆到三个已验证的配对中，每个配对具有不同的群体比例。还交换了克隆到每个组成营养缺陷型菌株中的基因，以形成“反向”共培养物。然后，比较WT单培养的OD600、葡萄糖消耗、β-丙氨酸和MSA(24 h和48 h)与具有分裂MSA生物合成途径的营养缺陷型菌株共培养的区别。正如预期的那样，发现随着接种比的变化，生长和产量都有很大的变化。OD600与葡萄糖消耗水平呈负相关，OD600的主要影响因素似乎是共养关系，因为无论通路的哪个基因在每个营养缺陷型中表达，最终的ODs都是相似的。与单一培养相比，trp2Δ-trp4Δ共培养的绝对滴度增加了两倍。此外，比较单位生物量的相对产量时，所有共培养的表现都比单一培养高出6倍。
图4 比较不同共养对合成MSA的能力
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41589-023-01341-2
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摘译 | 张思琪
编辑 | 王咏桐
左莎莎
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