图1 基因组中的“变数”——胞嘧啶和它的朋友们
图 2 表观遗传与一般遗传在分子生物学层面的区别（A）；表观遗传调控的两种形式：DNA 甲基化和组蛋白修饰（B）；表观遗传学：孩子成年后的抑郁可能与妈妈的早期生活压力有关（C）。参考出版物《Epigenetics: A Missing Link Between Early Life Stress and Depression》《Interactionsofearly-life stress with the genome and epigenome: from prenatal stress to psychiatric disorders》。
图3 mC 抑制基因表达的两种途径(A); DNA 甲基化和组蛋白标记共同作用，使得染色体收缩，抑制 GFP 基因表达（B）；移除 mC 标记后，染色体得以打开，可以进行转录(C)。
DNA 甲基化水平并不是只能单向增加，细胞在不同生命阶段其甲基化水平可能发生减少。研究人员在胚胎干细胞，神经细胞，肿瘤细胞等细胞的不同生理阶段都观察到了甲基化水平降低的现象。在胚胎细胞的细胞分裂过程中，通常会观察到全基因组的 mC 去甲基化现象。这一过程通常被认为是 DNA 复制与 DNA 甲基转移酶（DNMT）抑制共同作用的结果。如图4所示，受精卵从刚刚形成到桑椹胚（morula）阶段，父源和母源 DNA 的甲基化水平都发生了明显下降。有趣的是，父源 DNA 和母源 DNA 的去甲基化过程采用了2种不同机理。从图中可以看出，母源 DNA 甲基化水平随细胞数量增加而降低。这是由于在这个阶段，负责甲基化的 DNMTs 被阻止进入细胞核完成其甲基化的工作，从而导致细胞分裂时新合成的 DNA 不再含有 mC。这样单个细胞内 mC 的含量就随着 DNA 的复制而被新生成的 DNA “稀释”了。上面的过程称为被动去甲基化。
图4 小鼠早期胚胎发育过程中的甲基化水平
主动去甲基化是一个复杂的生物学过程，有多种酶和系统参与其中。该过程首先由 TET（催化，mC 被氧化为 hmC，随后进一步转化为 fC 和 CaC。这两种中间产物作为碱基切除修复（base excision repair，BER）酶的底物，可以被如胸腺嘧啶 DNA 糖苷酶（Thymine-DNA glycosylase，TDG）和单链选择性单功能尿嘧啶-DNA 糖苷酶（Single-Strand Selective Monofunctional Uracil-DNA Glycosylase，SMUG）等酶识别并切除，形成无碱基位点。接着，DNA 聚合酶可以用正常的胞嘧啶 C 填充这些无碱基位点，完成去甲基化过程。
图5 哺乳动物 DNA 去甲基化的可能路线
表观遗传学新碱基的研究离不开各种针对性的检测工具。目前，5-甲基胞嘧啶（mC）的检测常采用 Bisulfite 测序技术，该技术通过亚硫酸盐处理将 mC 转化为碱基 T。通过比较亚硫酸盐处理与未处理样品的测序结果，可以确定 mC 在 DNA 序列中的具体位置。在甲基化测序领域，Salus Pro 基因测序仪展现出卓越的性能（具体数据评测结果详见数据评测丨Salus Pro基因测序仪在全基因组甲基化测序表现卓越）。
hmC 的最早发现和验证采用了一种非常“传统”的检测手段——二维薄层层析（2D-TLC）。这是一种在有机化学中常用的 TLC 点板技术的二维形式。尽管方法传统，但它非常有效，成功证明了 hmC 的存在，并在《Science》杂志上发表。当然，这种方法主要用于定性分析，几乎无法进行定量检测。早期对这些新碱基的定量检测主要依赖于质谱技术。随着科研人员在检测技术方面的不懈努力，逐渐发展出多种改进方法。这些方法包括制备特异性荧光探针、改良免疫沉淀技术，以及结合现有测序技术实现单碱基分辨率的表观遗传学新碱基检测（图6）。详情参考《Chemical Methods to Identify Epigenetic Modifications in Cytosine Bases》。
图6 不借助 Bisulfite 测序直接检测 fC，达到单碱基分辨率
参考文献：
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