ME丨卡尔加里大学Dae-kyun Ro教授团队重构姜黄素合成途径揭示咖啡酰莽草酸酯酶在苯丙素代谢流中的作用

文摘   2024-10-17 08:00   湖南  

2024年3月,卡尔加里大学生物科学系Dae-kyun Ro教授团队在中科院一区TOP期刊Metabolic Engineering发表研究论文“Reconstructing curcumin biosynthesis in yeast reveals the implication of caffeoyl-shikimate esterase in phenylpropanoid metabolic flux”。该研究通过在酵母中重建姜黄素途径间接检测阿魏酰辅酶A,比较了传统和替代苯丙素途径生产阿魏酰辅酶A的生物合成效率。通过开发一种新型的模块化多重基因组编辑(MMG-CRISPR)平台,结合代谢工程策略,替代的咖啡酰莽草酸酯酶(CSE)苯丙素通路在工程化酵母菌株中的姜黄素产量出比传统通路高2-19倍。采用不含苯丙氨酸的合成基础培养基进行摇瓶培养,姜黄素的最高产量达到1.5 mg/L,相较于未工程化的基础菌株提高了约4800倍。该研究首次实现了酵母中姜黄素的从头合成,证明了通过在苯丙素途径中选择合适的酶,可以合成更高纯度的姜黄素或其他姜黄类化合物,为实现对单一类型姜黄素更精确的研究奠定了基础。卡尔加里大学Joseph Christian Utomo为论文的第一作者,Dae-kyun Ro为论文的通讯作者。




多种苯丙素在植物的发育和生态生理方面发挥关键作用,如木质部中的木质素、防御昆虫和病原体的抗毒素以及共生根瘤形成的信号分子,并且它们对人类健康也存在一定影响。苯丙素的传统合成途径以苯丙氨酸为起始底物,通过一系列酶的催化生成阿魏酰辅酶A。最近两项研究报道了两种新酶,表明存在替代的苯丙素合成途径:第一种(红色)酶是CSE,可催化咖啡酰莽草酸到咖啡酸,再经过4-香豆酸-CoA 连接酶(4CL)和咖啡酰辅酶 A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)催化形成阿魏酰辅酶A;第二种酶(绿色)为对香豆酸-3-羟化酶(C3H),可以直接催化对香豆酸羟基化为咖啡酸,再经过咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)和4CL催化形成阿魏酰辅酶A(图1)。

图1 三种苯丙素和姜黄素合成途径


然而,目前尚未评估这三条途径在酵母中合成下游苯丙素的效率。为此,该研究开发并利用MMG-CRISPR平台构建了三种苯丙素途径,在以上含不同苯丙素途径的菌株中重建姜黄素途径,转入合成姜黄素的二酮辅酶A合酶(DCS)与姜黄素合酶(CURS)基因,完成了各菌株构建(图2)。这项研究首次实现了酵母中姜黄素的从头合成,为实现对单一类型姜黄素更精确的研究奠定了基础。

图2 MMG-CRISPR 平台组件和工作流程


模块化多重基因整合的开发

为提高在酵母基因组中整合多基因模块的效率,研究者开发了MMG-CRISPR 平台。基于先前SGM-CRISPR研究成果,采用酵母菌株SBY104,通过设计和验证多个合成gRNA靶标,最终选择了效率为97.7%的gRNA1作为第二模块靶标。该模块在SBY104中整合到多个位点,生成在其基因组中含有一个到三个拷贝的第二gRNA靶标的新菌株SBY214、SBY224和SBY234。进一步将第二个gRNA的额外拷贝添加到靠近EFT1基因的安全整合位点,形成SBY244菌株。通过PCR扩增和测序确认了所有靶标的正确整合,获得的酵母菌株可通过两轮转化整合两个多基因模块(图2)。


苯丙素类化合物的生物合成途径设计与整合

通过设计三条不同的苯丙素类化合物生物合成途径(BdC3H途径、传统的HCT途径和HCT-CSE途径),探讨了阿魏酰辅酶A的合成效率。采用MMG-CRISPR平台,将每条途径分为两个模块,其中第一个模块负责对香豆酰辅酶A的合成,第二个模块包含每条途径中剩余的关键酶。不同途径采用了来自拟南芥的4CL异构体,以适应不同的中间代谢物。通过PCR基因分型确认了基因的正确整合,最终成功构建了表达各途径基因的酵母菌株。这些菌株被用于评估姜黄素的产量,并验证了不同途径的代谢效率。


含苯丙氨酸培养基中酵母的姜黄素生物合成

两个姜黄素生物合成基因DCSCURS1被克隆到含有细胞色素P450还原酶(CPR)的附加型pESC-URA质粒中。将构建菌株在完全培养基(含苯丙氨酸)中培养,通过液相色谱法检测发现,HCT和HCT-CSE途径菌株均可以成功合成姜黄素(图3A),而BdC3H途径菌株未检测到姜黄素。尽管HCT和HCT-CSE这两种途径可以合成姜黄素,但滴度都仅为0.2 μg/L。基因分型确认了BdC3H途径的基因已整合到酵母基因组中,但该途径无法利用其底物p-香豆酸。BdC3H途径的复杂性阻碍了姜黄素的合成,因此研究重心转移到HCT和HCT-CSE途径的表征上。

图3 液相色谱检测姜黄素


酵母内源基因代谢工程以提高姜黄素产量

通过HCT和HCT-CSE两种途径的菌株代谢提取物检测,发现了导致姜黄素滴度低的原因——两种途径均存在副产物根皮酸的积累。根皮酸是由一种酵母内源性双键还原酶TSC13催化对香豆酰辅酶A合成的(图3B)。TSC13是酿酒酵母中唯一的反式-2-烯酰辅酶A还原酶,能够催化极长链脂肪酸(VLCFAs)的延伸。选择了两种MdECR的替代策略,一种是在天然的TSC13启动子(pNat)下表达MdECR,另一种是在强组成型启动子TDH3(pTDH)下表达MdECR。LC-MS分析表明,在HCT和HCT-CSE途径中,使用MdECR替代的酵母菌株产生的姜黄素滴度显著高于使用TSC13的天然酵母菌株(图4,图5A)。在替换TSC13MdECR之前,HCT和HCT-CSE途径的姜黄素产量仅达到0.3 μg/L,而替换MdECR后,HCT和HCT-CSE途径的最高平均产量分别达到0.34 mg/L和0.96 mg/L(表1)。同时探究了姜黄素能否在酵母中从头合成,使用不含苯丙氨酸的SD培养基培养,最终检测到姜黄素滴度为1.5 mg/L,表明姜黄素可以在酵母中从头合成(图5A)。

图4 信号肽文库和RBS/NCS文库的构建策略


图5 各菌株合成姜黄素滴度及姜黄素比例


表1 不同酵母菌株中姜黄类化合物的滴度


HCT和HCT-CSE途径中姜黄素的产量差异

HCT和HCT-CSE途径在姜黄素类化合物的产量和组成上存在显著差异(图5B)。姜黄类化合物包括姜黄素、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin, DM-姜黄素)和双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin, BDM-姜黄素)三种。采用MdECR替代TSC13的酵母菌株表明,无论启动子类型,HCT途径倾向于生成更多的BDM-姜黄素和DM-姜黄素,而HCT-CSE途径则几乎完全生产高纯度的姜黄素。这种差异源于HCT-CSE途径能够更有效地将对香豆酰辅酶A转化为阿魏酰辅酶A,从而减少对香豆酰辅酶A的积累。



原文链接:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717624000272



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摘译 | 陈嘉序

编辑 | 王咏桐

          左莎莎

          陈嘉序

审核 | 刘   娟

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