植物抗病过程中会激活不同层次的免疫反应，需要消耗大量的能量和代谢物质，往往会影响植物的生长发育和产量，因此植物进化出一套精细复杂的信号调控网络以调控自身生长和防御的平衡。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联和钙依赖性蛋白激酶(CDPK）是植物生长发育、抗病、抗逆等信号传导通路的枢纽。然而，这两种关键的蛋白激酶如何平衡植物的生长和抗病仍然未知。
2022年8月3日，由华中农业大学谢卡斌课题组与宾夕法尼亚州立大学Yang Yinong教授发表在Plant Biotechnology Journal上的题为"Fine-tuning OsCPK18/OsCPK4 activity via genome editing of phosphorylation motif improves rice yield and immunity"的文章。该文章揭示了水稻中两个第IV亚家族的钙调蛋白激酶OsCPK18和OsCPK4调控水稻生长和抗病平衡的分子机制。研究人员发现OsCPK18和OsCPK是水稻平衡生长和抗病的关键调控因子，并发现OsCPK18和OsCPK4的活性受OsMPK5的磷酸化调控，而利用CRISPR/Cas9编辑此磷酸化位点可获得产量和抗病性同时提高的水稻材料。该研究结果如下：
1、OsCPK18 和 OsCPK4 调节与产量相关的性状和防御机制
研究者选用不同基因型的植物在植物的高度、千粒重、每株产量、真菌量等指标上进行对比试验，使用统计学的方法来分析数据，如百分比的变化和显著标记。研究结果显示某些基因型如OsCPK18-AC-1和OsCPK18-AC-2的植物高度显著高于WT，而OsCPK18-RI、OsCPK4-KO植物的高度则低于WT。此外，不同基因型植物的千粒重、产量以及真菌量也有所变化，表明特定基因的敲除或过表达对植物的生长和产量有显著影响。
图1：水稻中OsCPK18和OsCPK4基因对生长和防御反应的调控差异。a和h.对照组(WT)、OsCPK18敲低(RI)、OsCPK18组成型激活(AC)以及OsCPK4基因敲除(KO)水稻的形态比较。b-g.对野生型(WT)、OsCPK18基因敲低(OsCPK18-RI)以及OsCPK18基因组成型激活(OsCPK18-AC)水稻的产量相关性状和抗病性进行了比较。i-n.对野生型和OsCPK4基因敲除(OsCPK4-KO)水稻的产量相关性状和抗病性进行了比较。
2、OsCPK18 和 OsMPK5 负向调控防御基因，但对生长相关基因的调控不同
研究目的为了探究OsMPK5是否与OsCPK18相似，能够调节水稻的产量相关性状和基础防御。研究结果发现，与野生型相比，OsMPK5的沉默和过表达植物在株高和有效分蘖数上没有显著变化。通过RNA测序，研究者比较了OsMPK5-RI和OsCPK18-RI幼苗的转录组，发现共有80个基因被OsCPK18和OsMPK5共同调控，其中61个基因表达变化相似，19个相反。GO富集分析显示，OsCPK18-RI植物中与发育和次级代谢过程相关的基因显著富集，而OsMPK5-RI植物中与内源刺激响应相关的基因富集。此外，两者都显著富集了与胁迫响应相关的基因。防御相关基因（PR5、PR10）和乙烯响应基因（OsERF1）在OsMPK5-RI和OsCPK18-RI中增加，证实了OsMPK5和OsCPK18协同调节水稻防御。然而，生长相关转录因子OsGRF10和OsEATB的表达被OsCPK18和OsMPK5相反地调控。
图2：水稻中OsCPK18和OsMPK5协同调控防御相关基因，但对生长基因的调控不同。a-c.OsMPK5-RI、OsMPK5-OX、WT植物的形态、株高、有效分蘖数。d.维恩图显示OsMPK5-RI和OsCPK18-RI差异表达基因（DEGs）的数量。e.热图显示OsMPK5-RI和OsCPK18-RI共有的的差异表基因。f.OsMPK5-OX和OsMPK5-RI株系中差异表达基因的GO富集分析。g-i.OsMPK5-RI和OsCPK18-RI和WT植物中防御和生长相关基因的相对表达量。
3、OsMPK5通过磷酸化T505位点调节OsCPK18的Ca2＋依赖性，进而影响激酶活性
研究首先确定OsMPK5在OsCPK18上的磷酸化位点，OsCPK18DA中的T15、T282、T505是OsMPK5磷酸化的候选位点。这三个位点在OsCPK18DA中被替换为天冬氨酸（D），OsCPK18DA带有D178A突变以消除自磷酸化。然后进行了体外激酶实验，使用多组氨酸标记的(His-)OsMPK5作为激酶，以及四种突变的His-OsCPK18蛋白（OsCPK18DA、OsCPK18DA-T15D、OsCPK18DA-T282D和OsCPK18DA-T505D）作为底物。激酶反应产物通过Phos-tag SDS-PAGE分析，该方法可以根据电泳迁移率的变化检测蛋白质磷酸化。在Phos-tag凝胶中，除了OsCPK18DA-T505D外，所有OsCPK18DA衍生的蛋白都检测到单一磷酸化蛋白带，这表明OsCPK18的T505是OsMPK5的唯一磷酸化位点。
进一步的体内实验也证实了这一点，使用了敏感的NanoLuc标签来检测OsCPK18DA衍生蛋白的表达。此外，实验发现OsCPK18的T505磷酸化对其稳定性和亚细胞定位没有影响，但可能调节了其对钙离子的敏感性。为了验证这一点，实验采用了ADP检测实验来比较OsCPK18和OsCPK18-T505D的激酶活性。结果显示，OsCPK18-T505D在低钙浓度下活性较高，但在高钙浓度下活性较低，表明OsMPK5通过磷酸化OsCPK18的T505位点来调节其对钙离子的依赖性。
图3：OsMPK5通过磷酸化OsCPK18的T505位点并调节其激酶活性。a.OsCPK18蛋白域的示意图。b.体外激酶实验。c.激活的OsMPK5在水稻原生质体中磷酸化OsCPK18。d.OsCPK18与其他拟南芥和水稻亚组IV CDPK的序列比对。e.OsCPK18和OsCPK18-T505D的Ca2+敏感性。使用ADP-Glo方法比较激酶活性。
4、编辑亚组IV CDPKs的OsMPK5磷酸化基序可以提高水稻的产量和免疫力。
研究者利用CRISPR/Cas9技术编辑了水稻中的OsCPK18和OsCPK4基因的MAPK磷酸化基序，以探究OsMPK5对它们的逆向磷酸化对水稻生长与防御权衡的影响。由于PAM序列和编辑窗口的限制，研究者无法直接编辑磷酸化残基的密码子，而是引入了移码突变来阻止OsMPK5的磷酸化。他们获得了编辑系OsCPK18-GE和OsCPK4-GE，并在T2代中筛选了无转基因的系进行评估。结果显示，与野生型植物相比，编辑后的植物表现出更高的产量和更强的抗病性，且稻穗大小和千粒重也有所增加。这表明编辑MAPK磷酸化位点产生了具有增益功能的OsCPK18/4等位基因，能够同时提高水稻的产量和免疫力。
图4：精确编辑OsCPK18的T505-P506或OsCPK4的S512-P513磷酸化基序可以提高产量和抗病性。a.CRISPR/Cas9介导的OsCPK18和OsCPK4中MAPK磷酸化基序的编辑。b-c.灌浆期OsCPK18-GE、OsCPK4-GE和野生型（cv ZH11）植物的形态。d.OsCPK18-GE、OsCPK4-GE和野生型水稻稻瘟病症状的照片。e-n. OsCPK18-GE、OsCPK4-GE和野生型植物的产量相关性状和抗病性。
5、编辑OsCPK18的磷酸化基序会对水稻产生双重效应。
研究使用CRISPR/Cas9技术编辑了OsCPK18和功能相似的OsCPK4的MAPK磷酸化基序。由于PAM序列和编辑窗口的限制，研究选择了在OsCPK18的T505和OsCPK4的S512之后引入移码突变的gRNA，以阻止OsMPK5的磷酸化。获得了OsCPK18-GE和OsCPK4-GE编辑系，其中纯合编辑系具有不同的移码突变。与野生型植物相比，这些磷酸化位点编辑的植物表现出更高的产量和更强的抗病性。OsCPK18-GE和OsCPK4-GE植物的千粒重和产量增加了16.9%–24.8%，稻瘟病抗性也显著提高。这些结果表明，编辑MAPK磷酸化位点产生了具有增益功能的OsCPK18/4等位基因，能同时提高水稻的产量和免疫力。
图5：OsCPK18磷酸化基序编辑的双重效应。a.OsCPK18和OsCPK18-GE等位基因的Ca2+敏感性。使用ADP-Glo试验和组蛋白III-S蛋白底物分析了激酶活性。b.通过Phos-tag SDS-PAGE后的胶内检测分析了带有NanoLuc标签的OsCPK18DA和OsCPK18DA-GE。c-f.使用分裂荧光素酶（LUC）互补试验比较OsMPK5与OsCPK18衍生蛋白之间的蛋白质相互作用。g.水稻中OsCPK18/4-OsMPK5调控回路的示意图。
