引言 /Introduction
自 2007 年诱导多能干细胞 (iPSCs) 技术问世以来，细胞重编程领域开始飞速发展。与此同时，越来越多的合成生物学工具被广泛应用于相关研究。重编程不仅涵盖了干细胞研究，还包括直接转分化（例如从皮肤成纤维细胞到神经元）。这一过程为疾病建模和探索细胞可塑性提供了新途径，但诸如转分化效率低下和技术成熟度有限等问题阻碍了其广泛应用。近年来，合成生物学作为一门交叉学科，为解决重编程中的核心问题提供了一系列强大的工具。
Nathan B. Wang、Adam M. Beitz、Katie Galloway丨作者
倪赫远 Michael丨整理
孟凡康、Ruiz、范锐丨审校
倪赫远 Michael
什么是细胞重编程
除多能细胞外，最近的研究表明，转录因子介导的重编程可将皮肤成纤维细胞直接转化为多种体细胞类型，包括神经元、神经前体、心肌细胞和造血细胞，省略了耗时的多能细胞生成过程。从一种体细胞类型重编程为另一种体细胞类型通常被称为转分化 (transdifferentiation) 或直接转换 (direct conversion)。虽然生成细胞类型的方案与细胞类型本身一样多种多样，但多能细胞和体细胞重编程的过程和策略却高度相似。
重编程细胞让我们可以为复杂疾病提供还原患者特异性的模型。对不同患者而言，一系列诸如患者本身的基因背景、其经历的生活环境、疾病历史等等都会使其疾病拥有不同的诱发和发展过程。重编程细胞让我们可以在细胞层面上捕捉且重现患者致病细胞的表型。由此，利用这些细胞作为研究神经、肌肉和心脏疾病的工具潜力巨大。
除了疾病建模，重编程还为研究细胞可塑性提供了试验平台。从研究细胞重编程所需的可塑性出发，诸如细胞如何保持稳定的细胞特性，以及为什么某些细胞具有不同的重编程或转化能力等问题或许可以得到解答。简单地过表达四个转录因子就能将细胞命运的整个轨迹重定向为 iPSC 的轨迹。如果这种相对简单的表达系统引导成纤维细胞 (fibroblast) 成为 iPSC，那么我们是不是能用反馈控制器 (feedback controllers) 等更复杂的合成生物电路做到更多呢？
利用合成生物学面对细胞编程的挑战
虽然细胞重编程潜力巨大，但低下的重编程效率限制了其应用。随着允许高效重编程的分子被发现以及相关应用技术的成熟，针对这些挑战的合成生物学工具也应运而生。
// 应对递送和转基因表达方面的挑战
有效的重编程需要高效地传递重编程因子和其他遗传元素。最初的重编程技术使用逆转录病毒 (retroviruses) 感染难以转染的原代细胞。然而，逆转录病毒的应用会受到种种问题的限制：例如基因沉默、其免疫原性和基因组整合上的困难。作为替代方案，人们开发了一系列新的传递模式，包括利用非整合病毒和 mRNA 递送重组因子。每种递送载体在疾病建模和再生医学方面都有不同的机会和挑战。
诱导重编程的基因元件可通过病毒或非病毒载体递送（图 1a）。如图 1b 和 1c 所示，病毒载体能在原代细胞中实现高转导效率、强转基因表达和广泛的取向性（tropism，即感染特定细胞类型的能力）。传统的慢病毒 (lentivirus) 和逆转录病毒 (retrovirus) 介导的转导将重编程因子整合到基因组中，从而实现长期表达（图 1b）。然而，由于随机插入突变的存在，整合会产生致癌风险。整合的转基因可以通过 Cre-lox 重组系统，在重编程转基因上加上 loxP 位点来消除。另外，仙台病毒 (sendai virus, SeVs) 和腺相关病毒 (adeno-associated virus, AAV) 等非整合病毒在保持合成构建体稳健、临时表达的同时，还具有更好的安全性。SeVs 已被成功用于体内重编程，以用重编程细胞替代小鼠受损的心脏组织。与 AAV 不同，SeV 可提供长期表达，并可通过各种方法（如 siRNA）在特定时间点去除。另一方面，AAV 因其免疫原性低而被广泛用于基因治疗（图 1d）。AAV 的共转导效率高，可将因子分离到单个 AAV 上，从而绕过 AAV 的低包装量问题来诱导体内重编程。
重编程因子的非病毒递送方法通常使用阳离子聚合物或脂质/脂质体将 DNA 或 RNA 直接递送到细胞中。尽管少见，但递送的 DNA 有风险会整合到宿主基因组中（图 1b）。为解决这一问题，人们开发出了无整合风险的非质粒方法。合成修饰的 mRNA 可以对人类原代成纤维细胞进行重编程，且这一方法有时比病毒介导的方法效率更高。虽然大多数重编程方法依赖于增加重编程因子的表达，但也有一些研究表明，减少重编程因子表达也可以用于细胞重编程：例如利用反义寡核苷酸( anti-sense oligonucleotides, ASOs) 敲除一个关键的剪接因子 (splicing factor) 可将星形胶质细胞转化为神经元。此外，注射反义寡核苷酸已被证明在治疗神经退行性疾病方面具有临床疗效和安全性，这为重编程提供了一种新的思路。另一种非病毒递送方法是利用转座子系统，如 PiggyBac 或 Sleeping Beauty。转座子系统通过质粒递送，当适当的转座酶表达时，整个构建可被切除。
虽然系统分析以上这些方法能够帮助方法的使用选择，目前还没有学者进行对所有传递方法的重编程效率以及衍生细胞的成熟度的综合实验验证。在一些已有的对比研究中，对病毒和非病毒介导的重编程传递方法的比较分析表明，病毒衍生的人类 iPSCs (human Induced pluripotent stem cells, hiPSCs) 与人类胚胎干细胞 (human embryonic stem cells, hESCs) 的转录组最为相似。因此，要想让细胞达到更完整的多能状态，可能需要通过病毒递送实现的，持续的转基因表达。然而，病毒和非病毒衍生的 hiPSCs 在心脏分化潜能方面均未显示出差异。总之，这些观察结果表明，递送方法会影响重编程细胞的多能状态，但不会影响分化潜能。更多该方向的研究将有助于我们进一步理解各种递送系统导致的重编程方式之间的差异。
细胞重编程有时需要让我们递送多个重编程因子，由此更有效的多因子感染以及利用化学计量平衡的一些方法可能会增强我们的重编程能力。利用编录了转录因子鸡尾酒的多顺反子盒 (polycistronic cassettes) 可确保转导或转染细胞获得重编程所需的所有转录因子（图 1e）。使用这个方法时，转录因子在基因盒上的排序决定了转录因子的化学计量配比，其中上游基因的表达量最高（图 1f）。在心肌细胞和树突状细胞重编程过程中，盒的排序会影响化学计量配比和重编程效率。相比之下，在神经重编程过程中，不同的因子比例却都能够成功将细胞重编程为运动神经元。
我们如何基于这些数据去理解多因子化学计量比例对重编程的影响呢？一项心肌细胞重编程实验或许可以解释这些矛盾的观察结果。仅从化学计量上考虑，他们的重编程系统在重编程因子排序为 Mef2c、Gata4 和 Tbx5 (MGT) 达到最高效率。但令人惊讶的是，在 SeV 递送的 Gata4、Mef2c 和 Tbx5 (GMT) 排序中，诱导心肌细胞重编程的效率比化学计量优化的逆转录病毒 MGT 更高。与逆转录病毒递送的 MGT 相比，SeV-GMT 能提高所有三种重编程因子（M、G 和 T）的表达水平，这可能是重编程效率提高的原因。因此，成功的重编程可能需要特定转录因子超过某些阈值，而不是满足重编程因子的精确比例。
利用合成生物学工具，我们可以通过做对重编程因子表达水平的系统性扰乱研究来解决这些以前文献中结论的不一致。正交的多转录因子加上合成启动子可在广泛的表达水平范围内提供可预测的表达。此外，降解肽标签 (degradation peptide tags) 可对蛋白质降解率进行可预测的控制。我们可以通过将这些合成调控因子整合到具有反馈控制功能的大型基因回路中来减少细胞的表达噪音。通过提供多层基因表达调控，合成生物学将实现对重编程因子水平的精确控制。
// 表观遗传学的重编程
转录因子介导的重编程依赖于找到最佳的转录因子鸡尾酒组合并以此重新定向细胞特性。然而，细胞可能在表观遗传层面上抑制转录因子进入不同的基因位点并让它们不能激活目标基因网络。为了解决这个问题，人们开发了各种小分子 + 基因的组合来总体提高基因组的可及性。组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylase) 抑制剂可阻止乙酰基 (acetyl groups) 从组蛋白中被移除。这些乙酰基可阻止 DNA 与组蛋白紧密结合，从而提高转录因子与同源位点的结合率。除了提高 DNA 可及性 (accessibility) 的鸡尾酒外，克服表观遗传学障碍的合成生物学方法还侧重于提高转录因子的“打开”一个或多个位点的能力，并由此激活调控网络。
很多转录因子通过与同源 (cognate) DNA 序列结合、招募转录机制和诱导转录来驱动染色质结构的变化。转录诱导可以重塑染色质，并可能可以通过核小体驱逐 (nucleosome eviction) 消除表观遗传障碍。由此，合成生物学方法也可以用来生成更好的合成转录因子。
CRISPR 激活因子 (CRISPRa) 等合成转录因子通过招募转录机制来诱导转录和表观遗传重塑，从而促进染色质结构的改变。通过 CRISPRa 靶向单个位点可以驱动细胞重编程所需的大规模染色质重塑。在将成纤维细胞重编程为 iPSCs 的过程中，以 Oct4 或 Sox2 为靶点的 CRISPRa 可分别满足 Oct4 或 Sox2 过表达的需要。CRISPRa 可替代原生因子生成神经元、骨骼肌和心脏祖细胞。此外，将 CRISPRa 与原有通路的信号活动连接起来的最新技术为通过细胞信号传递的基因座激活提供了可能性，使信号活动与重编程之间得以协调。虽然 CRISPRa 技术提供了可编程的特异性位点激活，但 dCas9 的大尺寸（基因长 4.5 kb）限制了其在载货量限制较小的病毒载体（如 AAV）中的应用。较小的 Cas 变体可以提高 CRISPRa 的灵活性，使其能够靶向初级细胞类型。
此外，合成生物学中基于建库的方法让我们不拘泥于利用目标系统的原有转录因子：我们还可以选择使用其他系统中的或人工的转录因子。例如，一组学者通过细胞选择和测序定向进化重编程因子，确定了 Sox17 的进化体可替代 Sox2 的变体，并能提高细胞重编程为 iPSC 的速度。另一组学者通过使用可以和 VP64 融合的锌指库 (zinc finger libraries)，确定了可以替代 Oct4 过表达的人工转录因子变体。有效的人工转录因子并不直接靶向 Oct4，而是似乎间接激活了细胞里的多能性网络。
总而言之，确定最佳重编程方案需要通过具体应用明确目标，无论是侧重于重编程效率、细胞成熟度还是进一步分化的潜力。随着对支持重编程的核心过程的深入了解，合成转录因子和组合可解决的问题将通过定向进化继续扩大。
// 克服供体特性的问题
细胞核心的既有基因调控网络与新诱导的基因调控网络 (gene regulatory networks, GRNs) 之间的竞争可能会限制细胞完全采用我们添加的替代特性。由此，扰乱原有的细胞信号通路或许可以帮助提高细胞重编程效率。
▲ 图 2: 潜在供体细胞所带来的挑战
对此，供体细胞中的原生信号传导为调整重编程提供了多种切入点（图 2a）。例如，添加促炎性转化生长因子 TGF-β 信号传导的小分子抑制剂可提高重编程效率。此外，抑制 IL-1β 及其下游效应因子可促进成年小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞。抑制这种促炎级联可改善出生后和成年成纤维细胞的重编程，而对胚胎成纤维细胞没有影响。基于发育阶段而存在的不同炎症反应表明，原生信号的额外层层调节可以阻止成熟细胞类型的重编程。衰老细胞会分泌 IL-6，它能以非细胞自主方式（即通过多细胞相互作用）促进 iPSCs 的生成。据推测，IL-6/STAT3 信号通路可诱导转录因子 NKX3-1 的表达，从而激活内源性 Oct4 的表达。Wnt 信号对重编程的影响高度依赖于具体情况。激活 Wnt 信号通路可增加成纤维细胞向 iPSCs 的重编程。此外，Wnt 信号可以触发 Müller 胶质细胞增殖并转化为神经元；然而，抑制 Wnt 可促进向心肌细胞的重编程。鉴于原生信号通路具有多种细胞特异性功能，将信号转导与重编程机制联系起来仍是一个重要目标。此外，将信号传导与调控联系起来的工具可实现根据通路活性进行调整的基因控制。合成生物学方法在调节和重定向这些通路（如产生通路响应转录因子）方面存在巨大潜力，可在异源细胞群中对重编程进行选择性、响应性、单细胞控制。
天然信号通路、表观遗传状态和细胞身份都通过机械转导与细胞骨架和细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 相连。除了提供机械支撑外，细胞骨架还能通过机械转导使细胞感知并响应其环境机械特性的变化（图 2c、2d）。此外，重编程阶段与细胞硬度的变化相关。新兴研究表明，利用机械力影响细胞变化可能会提高重编程效率和细胞成熟度。
基质的机械特性会影响定向分化和 iPSC 重编程。例如，基质硬度可与可溶性诱导因子相互作用，引导分化并决定 PSCs/iPSCs 的系承。目前通过调节细胞硬度改善重编程的方法要么针对肌动蛋白细胞骨架，要么改变基质的机械特性。较软的基质可减少肌动蛋白纤维的硬度，促进间充质干细胞重编程为 iPSCs。最近的证据表明，细胞硬度会阻碍染色质的可及性和完全多能性。机械传导信号也能以非细胞自主方式影响重编程。例如，过表达 YAP，一种对机械敏感的转录共激活因子，会增加共培养细胞的重编程，但不会增加表达 YAP 细胞的重编程。信号和机械线索的复杂相互作用及其对基因调控网络的反馈会需要学者采用整合性的方法来模拟和探究细胞命运转换的途径和过程。
鉴于细胞过程的高度交织和细胞特性的竞争，通过 miRNAs 抑制相互竞争的 GRNs 是重编程的一个重要工具（图 2b）。单独或与转录因子结合过表达细胞类型特异性 miRNA 可使细胞重编程为 iPSCs、心肌细胞和神经元。据近期文献，在将成纤维细胞重编程为心肌细胞的过程中，用 miR-133 补充心肌细胞转录因子鸡尾酒可直接抑制成纤维细胞转录因子 Snai1。通过转录后效应和下游翻译后效应，miRNA 的表达直接影响表观遗传屏障和供体细胞 GRN，从而促进重编程。
信号通路、GRNs、表观遗传学状态和细胞骨架元素的组合决定了细胞特性的分子决定因素，从而赋予细胞独特的形态和功能。单个分子决定因素可协调单个过程，而多层调控则支持稳定特性的维持，缓冲细胞命运的转变。这些分子网络的高度整合性要求采用系统级的方法和精确的工具来剖析强化细胞特性的多个调控层。
从工具到系统：重编程系统生物学带来的启示
▲ 图 3: 各种输入会介由一系列分子活动来引导细胞进入重新编程状态
重编程的罕见性表明，一部分特定细胞克隆会被优先进行重编程。系谱追踪实验证实，这些特定的“精英”克隆在成功的重编程事件中占主导地位。最近，人们发现了标记“特权细胞”的机制。拥有更快细胞周期的细胞一般优先重编程为 iPSCs。除 iPSCs 外，超增殖 (hyperproliferation) 还能促进重编程为多个分裂后系，这表明短暂的超增殖能广泛增强重编程。在转换过程中，快速复制可能会促进高度稳定的 mRNA、miRNA 和蛋白质的稀释，否则可能会限制完全的细胞重编程。设计有利于稀释分子成分的重编程方案可提高重编程效率和衍生细胞的成熟度。
在过度增殖的细胞中维持转基因表达可能是改善通过逆转录病毒递送诱导的重编程的一个挑战。在超增殖细胞中，逆转录病毒转基因表达被沉默的频率更高。此外，逆转录病毒沉默似乎取决于是否存在特定的重编程因子，并可能独立于重编程发生。例如，在诱导多能性的关键标志物之前，Sox2 和 Mycco 表达会激活体细胞中的逆转录病毒沉默机制。相反，表达荧光标记的细胞中的逆转录病毒沉默与较高的重编程率正相关。然而，逆转录病毒递送的转基因沉默（如标记表达丧失）可能只是与增殖相关，而不是成功重编程的标志。另外，虽然转基因沉默在逆转录病毒中已得到证实，但目前仍不清楚其他传递机制是否会受到细胞周期介导的沉默的限制，或者能否消除增殖与转基因表达之间的权衡。
除了过度增殖和转基因表达外，核组织和不同的转录速率也被认为是重编程潜力的重要标志。增强子等非编码调控区周围结构的变化可能会促进核结构和基因表达的变化，从而促进重编程。此外，转录也会推动染色质结构和核组织的变化。因此，较高的转录率可能会促进染色质的快速重塑和核组织的诱导，从而促进新基因组网络的建立。目前我们还不清楚高转录率的过程或产物是否会促进重编程。
合成生物学在重编程领域的未来
通过基因回路对基因表达进行精确的时序控制是合成生物学的一个标志。高增益反馈控制器可实现对转录因子表达的精确控制。虽然在哺乳动物系统中设计基因控制器的理论和工具已迅速扩展，但直到最近，重编程的关键控制目标仍未明确。作者最近的工作揭示了通过动态目标定制异步重编程细胞内转录因子表达的机会。
▲ 图 4: 合成生物学在细胞重编程领域的未来
虽然转录驱动着细胞状态的变化，但重编程早期的高转录率会抑制增殖并阻碍重编程。因此，高转录和高增殖代表了一项重编程过程中的动态目标。开发减少供体 GRN 转录和调整重编程因子表达的策略，可促进更快速、高效的重编程。为了有效平衡这两个过程，根据单个细胞的能力调整转录量的重编程载体可通过限制基因组的转录负荷来改进重编程策略。简单选择启动子来调控转录因子的表达，可能就足以改善转基因构建体的表达规模（图 4a）。最近开发的细胞状态特异性启动子库为调整基因表达提供了多种元件。此外，鉴于信号通路在诱导细胞命运变化方面的作用，信号响应基因控制器可通过协调信号、细胞周期和转录因子的表达来加强重编程。另外，带通滤波器 (bandpass filters) 和脉冲发生器 (pulse generators) 等更复杂的反馈控制系统可提供时序上确定的基因表达脉冲。将这些调控工具连接在一起，就能产生能够感知细胞状态并协调最佳驱动反应的控制器，从而引导每个细胞形成新的特征。
虽然重编程主要侧重于细胞自主工程，但非细胞自主的相互作用也会导致一系列细胞行为。合成多细胞相互作用的进一步科研成果可让我们能够把控细胞间的精确交流，从而实现复杂的时空协调，并使复杂的重编程细胞成熟过程成为可能。例如，表达 YAP 的细胞通过细胞间信号传递提高了 YAP 阴性细胞的重编程率。同样，IL-6 的分泌也能以非细胞自主方式促进 iPSCs 的生成。非细胞自主过程能够将工程系统分隔为明确定义的“发送”细胞和“接收”细胞（图 4b）。开发由发送者和接收者细胞组成的多细胞重编程龛位可协调多细胞过程，并将特定的基因操作限制在一个细胞子集。例如，过表达突变型 RAS 会以非细胞自主的方式诱导细胞增殖。鉴于增殖是重编程的关键决定因素，可将促进增殖的致癌程序限制在发送细胞中，从而为重编程的接收细胞保留无致癌基因的特征。合成重编程联合体的开发可通过有限的基因操作提高重编程效率，从而加速重编程细胞的转化。
除了发展合成重编程联合体，合成受体系统还可促进复杂的模式化，实现对细胞命运的时空控制。合成受体系统提供了一种协调重编程因子表达与细胞外信号传导的正交机制。例如，模块化细胞外传感器结构 (modular extracellular sensor architecture, MESA) 受体通过释放系链转录因子来诱导基因表达，从而对可溶性细胞外信号做出反应。同样，合成 Notch 受体 (synNotch) 也会释放系链转录因子以响应细胞-细胞接触。通过设计 synNotch 控制的粘附素表达，可对不同粘附性的细胞进行编程，以形成自我图案化的多细胞结构。将综合多细胞联合方法与调控不同细胞命运的合成受体系统相结合，将为研究和构建多细胞组织提供独特的环境。
模拟了小规模转录网络的基因线路可用来模拟大规模网络。通过与“大规模”系统生物学技术（包括基因组学、表观基因组学和基因组结构）的连接，这些“小规模”系统在标记和识别独特群体和细胞状态方面将具有进一步成就。大规模系统可提供单个时间点的高维剖析，而电路等小规模系统则可通过电路活动等低维综合指标进行动态跟踪。通过跨尺度连接实验设计，我们可以加强“设计-构建-测试”工作流程，开发独特细胞状态的活细胞报告器，优化基因控制器，并制定评估和提高重编程细胞成熟度的策略（图 4c）。
系谱追踪工具为研究单个克隆如何促进重编程提供了一种方法（图 4d）。鉴于重编程的罕见性和细胞反应的异质性，重建重编程系谱和分离成功重编程细胞祖细胞的合成生物学方法可能会澄清供体细胞内在障碍对重编程的作用。通过条形码标记 (barcoding) 起始细胞群进行系谱追踪发现，相对较少的精英克隆可从小鼠胚胎成纤维细胞 (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) 重编程为 iPSCs。最新的克隆回溯鉴定方法拓展了条形码标记的潜力。异质细胞群克隆的 CRISPRa 追踪 (CaTCH) 系统依赖于在报告基因上游标记条形码的细胞群分裂。根据表型筛选出的克隆通过测序进行富集和鉴定。在富集克隆的独特条形码上导入引导 RNA，可激活报告基因的表达，从而通过各种扰动对克隆进行实时跟踪。有了这种方法，我们就有可能进一步研究对细胞命运转变中的克隆确定性和遍历性。
在这些条形码标记策略的基础上，新开发的工具实现了动态条形码，不仅能识别祖细胞克隆，还能重建整个细胞系。动态条形码依靠 Cas9 或其他 DNA 重组酶的随机重组事件，在重编程过程中对细胞进行唯一标记。为改善追踪，条形码可在原位读出，从而保留空间和形态数据。重要的是，条形码还可与单细胞 RNA 测序方法结合使用，将条形码置于转基因的非翻译区，将转录谱映射到独特的细胞和群体中。世系追踪需要 DNA 编辑机制（Cas9、sgRNA）的持续作用，而事件记录则是通过将编辑与细胞事件（如信号转导）联系起来实现的。并行实施品系追踪和事件记录电路可阐明促成或抑制重编程的瞬时事件。此外，激活活细胞报告器的事件记录电路可在纵向追踪重编程群体时提高亚细胞事件的时间分辨率，也可利用测序技术读取。了解重编程过程中各种细胞状态的分子障碍有助于制定促进成熟的策略。
通过将细胞系和事件信息与单细胞转录组学联系起来，合成生物学可将“小规模”事件与“大规模”系统数据联系起来，并可阐明精英细胞克服重编程和成熟障碍的机制。将基因组学数据纳入“设计-构建-测试”循环，将大大提高我们对细胞命运转换合成基因控制器的理解和工程设计。
虽然合成生物学是在单细胞生物体中发展起来的，但最近其向哺乳动物系统的扩展为细胞命运的研究和工程提供了丰富的资源。随着研究哺乳动物系统中信号传导、染色质结构和基因调控的新型工具的不断发展，合成生物学将使我们能够以前所未有的方式深入了解重编程的机制，并扩大我们设计重编程细胞的能力。
https://doi.org/10.1016/j.coisb.2020.09.002
\ END \
