【摘要】
本文综述了小分子抗体制备技术的最新进展，重点介绍了半抗原的设计和合成、半抗原与载体的偶联、人工抗原的纯化和鉴定以及特异性抗体的制备。此外，本文还评估了当前技术的缺陷和局限性，同时展望了了人工抗原合成和抗体制备技术的未来趋势。
【引言】
当前，小分子化合物在医药、食品安全和环境监测中扮演着至关重要的角色。它们不仅是许多药物和生物活性分子的核心组成部分，也是疾病诊断和环境评估的关键指标。由于小分子化合物的分子量低、抗原性弱，传统的检测方法往往无法有效识别和量化这些微量物质。为了克服这一挑战，科学家们发展了免疫分析技术，该技术利用抗原和抗体之间的特异性相互作用，为小分子化合物的检测提供了一种高灵敏度、高特异性的检测方案。
进行免疫分析检测需要相对应的抗原和抗体。抗体制备过程主要包括半抗原的设计和合成、半抗原与载体的偶联、人工抗原的纯化和鉴定、特异性抗体的筛选这几个环节。本篇文章重点介绍了上述环节的对应的研究进展，展望了了人工抗原合成和抗体制备技术的未来趋势。
【内容介绍】
1. 背景
小分子化合物，通常指分子量在100至1000 Da之间的有机化合物，在生物医学、食品安全和环境保护中扮演着重要角色。在生物医学领域，小分子化合物是构成大分子如蛋白质和核酸的基本单元，也是大多数药物的骨架。在机体代谢和疾病发展、诊断、治疗中，这些分子均能起到关键作用。在食品安全领域，添加剂、农药等可能引起过敏反应或中毒，检测这些物质有助于确保食品符合安全法规，保护消费者健康。在环境监测领域，对空气、水和土壤中的小分子化合物的污染水平的准确评估对指导环境管理和保护至关重要。
常用的小分子化合物鉴定技术包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、质谱法（MS）、核磁共振（NMR）光谱法、免疫测定法和毒理学分析。其中，高效液相色谱法等仪器分析方法需要精密的设备，复杂的样品处理，较高的检测成本限制了其广泛使用。而免疫测定技术，利用免疫学原理对小分子化合物进行分析，具有高灵敏度、特异性、快速定量和自动化的特点，与其它方法对比，有着无法比拟的优势。
2. 半抗原的设计和合成
将半抗原与载体蛋白偶联形成完整的抗原对于产生针对小分子化合物的特异性抗体至关重要。然而，并非所有小分子都能直接与载体偶联，因此需要先对小分子化合物进行设计和加工，合成可结合载体蛋白的半抗原。
2.1半抗原的设计
Goodrow等人提出了设计半抗原和完整抗原的指导原则，包括半抗原的结构特征应与原始小分子物质相似、选择合适长度的连接臂、基于原始半抗原的化学性质选择半抗原与载体蛋白的偶联位点。
半抗原设计大多依赖于经验和试错方法，这使得预测合成后的效果具有挑战性。计算机辅助分子建模的出现促进了半抗原设计的发展。这项技术可识别目标分子的各种特征、设计各种结构和电子分布与原始分子相似的半抗原、并通过计算对接和分子动力学模拟选择与载体结合亲和力更高，稳定性更强的半抗原。如Quan等人利用计算机辅助建模分析，设计合成了四种新型6-苄基氨基嘌呤（6-BA）半抗原，得到了一种高特异性、高敏感性的抗体。基于该抗体建立了一种高灵敏度的间接竞争性酶联免疫吸附试验（icELISA），其50%抑制浓度（IC50）为1.18 μg L−1，检测限为0.075 μg L−1。
半抗原的合成主要有两种途径：结构修饰或从头合成。修饰的常用化学方法包括：（1）氧化：将特定基团转化为更具活性的形式（如将羟基和胺转化为醛和酮）。(2)还原：利用还原剂（如二硫苏糖醇（DTT））将二硫键转化为巯基，使其与载体蛋白上的氨基或其他活性基团形成共价键，形成完整的抗原。(3)水解：裂解酯或酰胺键生成羧酸和醇或胺，在半抗原分子上引入羧基或氨基等官能团。(4)取代：通过亲核或亲电取代反应，将新的官能团如羧基、氨基或羟基引入半抗原分子，从而改变其化学性质和生物活性。表1详细说明了这些修饰方法。
表1半抗原活性基团的化学改性方法及反应原理
2.2间隔臂（Spacer arm）的选择
间隔臂通常为碳链，作用为连接半抗原与载体，确保小分子化合物半抗原的独特结构远离载体，以最大化暴露于免疫系统。在选择间隔臂时，需要考虑多个因素，包括连接位点、间隔臂结构和长度。
（1）连接位点：连接位点的引入必须确保半抗原的特征性结构不受影响，并且完全暴露以增强抗体的特异性。例如Sabina等人利用尼古丁（nicotine）中吡啶环的5-或6-位作为尼古丁半抗原连接位点。这种方法增加了吡啶环的抗原性，降低了生成的抗体与尼古丁代谢物之间的交叉反应性。
（2）间隔臂的结构：应尽量减少引入具有共轭双键或杂环的连接臂，以防止抗原和抗体之间的电子吸引或排斥，进而导致非特异性抗原-抗体反应。在Zhang的研究中，基于几何结构和静电势能（ESP）分析了六种不同结臂长度和结构的辣椒素半抗原的免疫效应。研究结果表明，通过碳碳双键与含有酰胺基团的长链烷基形成刚性连接臂可以增强免疫原性。
（3）间隔臂的长度：间隔臂较短可能导致载体蛋白的空间位阻，阻止半抗原特征结构完全暴露，从而影响免疫系统的识别。相反地，增加间隔臂的长度可以减轻载体的屏蔽效应，导致抗体对半抗原的特异性提高。Bai等通过调节三聚氰胺和硝基苯胺间隔臂中的碳原子长度研究诱导抗体的效力和血清亲和力。结果表明，含有6-8个碳原子的间隔臂，长度为6.3-8.8 Å，可有效地产生高效价和高亲和力的抗体，最大限度地降低空间位阻。但间隔臂的长度也并非简单的越长越好，过长的间隔臂可能由于内部或外部影响而发生“折叠”，使半抗原的特征结构无法充分暴露，使其无法被免疫系统识别。一般来说，间隔臂长度为3-6个原子是效果最佳的。
3. 半抗原与载体的偶联
3.1载体的选择
载体是运输半抗原和增加其相对分子量所必需的。载体的特异性和免疫原性对诱导免疫反应和使机体识别半抗原至关重要。选择载体时，必须考虑载体的各种特性，特别是其免疫原性和活性基团的数量。最常用的载体是蛋白质，包括牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）、甲状腺球蛋白（TG）和免疫球蛋白（Ig）。近年来，肽和大分子聚合物因其酶的水解作用和无毒降解产物而被用作偶联载体。如聚赖氨酸和二丁基赖氨酸。此外，纳米材料由于其可调节的物理化学性质和可控制的载荷释放而成为共轭载体，如碳纳米管（CNTs）。
3.2偶联方法和偶联剂的选择
半抗原与载体偶联的常用方法是化学偶联，即利用偶联剂在抗原与载体之间形成共价键。所选择的具体方法取决于半抗原中活性基团的类型，如表2所示。基因工程技术目前也应用于半抗原与载体蛋白的偶联，一般以融合蛋白的形式表达。该技术目前仅用于lewis体碳水化合物抗原、人工真菌毒素抗原和短肽抗原的制备。
表2不同半抗原与载体的偶联与鉴定
每种半抗原根据其独特的化学结构和活性基团，在与载体偶联时，需要特定的偶联剂。这些试剂一般不改变抗原的特征结构和免疫效应。常见的偶联剂包括：1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）、n -羟基琥珀酰亚胺（NHS）、戊二醛、N-β-马来酰亚胺-琥珀酸-4-磺酸盐（SMCC）、琥珀酸二琥珀酰氨基酯（DSS）、无水三乙胺(PMDETA)、双（磺基琥珀酰）琥珀酸酯（BS3）。
4. 人工抗原的纯化和鉴定
4.1人工抗原的纯化
除目标产物外，反应混合物中还含有未反应的半抗原、游离载体、盐等小分子，因此需要对人工抗原进行进一步纯化。常用的纯化方法有离心、透析、层析、超滤、沉淀、凝胶层析等。离心法具有速度快、操作简单、纯度高、活性保留等优点，但纯化率低，且对小分子的纯化无效。透析法虽然耗时，但能提供有效的净化，而且操作简单。凝胶色谱法允许快速纯化，但是较为复杂，需要进行成分分析，以确定目标产品。超滤提供高分辨率，易于操作且具有广泛的适用性，但受分子尺寸限制和过滤膜维护成本的限制。
4.2人工抗原的鉴定
鉴定的目的是确认半抗原与载体的成功结合并达到预期的免疫应答。已有的鉴定方法包括质谱法（MS）、核磁共振法（NMR）、红外光谱法（IR）、紫外光谱法（UV）、荧光光谱法（UV）、圆二色光谱法、凝胶-高效液相色谱法（GPC）、原子力显微镜法（AFM）、元素示踪法、元素分析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）、电喷雾电离质谱法（ESI-MS）、基质辅助激光解吸法、电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）、 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）和考马斯亮蓝法。其中，紫外光谱和MALDI-TOF-MS是最常用的技术。HPLC、MS和NMR提供高精度和详细的结构信息，使它们适合于鉴定复杂分子。相反，UV-Vis、薄层色谱（TLC）和电泳更适合快速筛选和初步鉴定。鉴定方法的选择应考虑敏感性、特异性、适用性和实验条件。方法的合理组合可以提高耦合产品识别的准确性和可靠性。
5. 特异性抗体的制备
目前应用最广泛的技术是单克隆抗体制备技术。随着基因工程技术的进步，重组抗体和单域抗体制备技术也得到了发展，这些方法越来越多地用于制备针对人工抗原的特异性抗体。
5.1多克隆抗体技术
目前，生产高亲和力抗体的常用方法是用目标抗原免疫动物，从免疫动物的血液中收集含有特异性多克隆抗体的血清，并采用各种免疫筛选和鉴定技术，如ELISA和western blotting，筛选特异性抗体。这些方法操作较为简单，但由于大多数人工抗原的表面组成复杂，免疫产生的抗体主要针对载体分子或连接臂的结构特征。大多抗体与半抗原-蛋白偶联物的亲和力更高，且所多克隆抗体不同免疫批次之间会有所不同。
5.2杂交瘤单克隆抗体技术
将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这些杂交瘤细胞可以在体外存活较长时间并分泌免疫球蛋白，再克隆单个杂交瘤细胞获得能够产生大量单克隆抗体的单克隆细胞系。该技术对制备针对小分子化合物的单克隆抗体具有高度特异性，良好的可重复性和可扩展性。然而，杂交瘤细胞系的潜在不稳定性、克隆偏好性和交叉反应性问题可能导致制备的单克隆抗体亲和力较低。
5.3基因工程抗体技术
基因工程抗体，又称重组抗体，是指利用重组DNA和蛋白质工程技术，根据特定要求对编码抗体的基因进行操纵和重组。将基因转染到受体细胞中，以表达所需的抗体分子。图1简要说明了各类抗体的制备过程。
图1 抗体产生流程图
阶段1：合成完整抗原。小分子物质经过结构设计，可以通过修饰或重新合成形成半抗原。随后，半抗原在适当条件下与载体偶联，形成完整抗原。阶段2：制备针对小分子物质的特异性抗体。
【小结】
在设计和合成半抗原时，须考虑多种因素，包括小分子的结构性质、修饰方法与位点、间隔臂长度与结构、偶联载体、偶联方法等。合成完全抗原后需进行纯化和鉴定后才可进行动物接种获得各类抗体(这个过程非必须，译者注)。各个环节均有多种方法可供选择，本篇综述阐述了各个方法的优缺点，并对其进行对比分析。
小分子化合物抗体制备技术具有重要的应用价值，也面临着重重挑战。生产过程的复杂性和成本、获得稳定的半抗原和特异性抗体的困难，都是当前的障碍。未来的研究应关注通过优化合成过程和技术来提高人工抗原的免疫原性和稳定性。开发更稳定、更有效的载体。加强跨学科合作，结合计算机数据库与创新技术，并引入自动化和高通量抗体筛选技术，将提高抗体制备的效率和成功率。这些进步将促进半抗原免疫检测技术的发展，并推动生命科学及相关领域小分子化合物的发展。
【原文出处】
Chen Y, Ma S, Zhou M, Yao Y, Gao X, Fan X, Wu G. Advancements in the preparation technology of small molecule artificial antigens and their specific antibodies: a comprehensive review. Analyst. 2024 Sep 9;149(18):4583-4599. doi: 10.1039/d4an00501e. PMID: 39140248.
原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/an/d4an00501e
指导老师：王战辉
