年度优秀论文 | 基于单细胞测序技术构建小鼠磨牙牙髓细胞的发育图谱

1.小鼠磨牙的单细胞转录组图谱：见图1，2 。小鼠0、3、7 d磨牙样本分别测序8 571、4 824和8 925个细胞，3个时点的样本共测序22 320个细胞。通过质控排除低质量细胞后，共计17 793个细胞进入后续分析。将3个时点样本整合后，所有细胞被分为26个亚群，将其定义为八大类细胞，分别为牙髓细胞（亚群0、3、7、12、14）、牙囊细胞（亚群1、13）、上皮细胞（亚群6、10、11、16、17、24）、免疫细胞（亚群4、8、15、19、21、23）、内皮细胞（亚群5、20）、管周细胞（亚群18）、胶质细胞（亚群25）和红细胞（亚群9、22）（ 图1A ）。亚群2的DEG不明显，因而无法分类（ 图2 ）。分别查看0、3、7 d样本的UMAP图，发现三者在细胞亚群分布上基本一致，但在亚群的细胞数量上有差别（ 图1B ）。

图1 不同发育时期小鼠磨牙的单细胞转录组测序及其整合分析  A：0、3、7 d 3个时点样本整合后的统一流形逼近和投影（UMAP）图（每个点代表1个细胞，不同颜色代表不同亚群，数字为亚群序号，虚线内表示该亚群定义为同一类细胞）；B：3个时点样本各自的UMAP图；C：5个主要细胞类型的标记基因在UMAP图上的表达情况，Dcn为核心蛋白聚糖，Ibsp为整合素结合唾液蛋白，Krt14为角蛋白14，Ptprc为蛋白酪氨酸磷酸酶受体C，Cdh5为血管内皮钙黏蛋白（颜色越深代表标记基因的表达量越高，灰色代表无表达）

图2 小鼠磨牙各细胞亚群的基因表达热图

根据DEG的特异性，从基因表达热图中各选择1个基因作为每种细胞的标记基因，其中核心蛋白聚糖（decorin，Dcn）主要表达于牙髓细胞，整合素结合唾液蛋白（integrin binding sialoprotein，Ibsp）主要表达于牙囊细胞，角蛋白14（keratin 14，Krt14）主要表达于上皮细胞，蛋白酪氨酸磷酸酶受体C（protein tyrosine phosphatase receptor type C，Ptprc）主要表达于免疫细胞，血管内皮钙黏蛋白（cadherin 5，Cdh5）主要表达于内皮细胞（ 图1C ）。管周细胞、胶质细胞和红细胞的标记基因见 图2 。在每种细胞内部各亚群之间，既有共同的DEG，又有各自特异性的DEG，如Krt14和角蛋白5（keratin5，Krt5）在上皮细胞所有亚群中均表达，而X-连锁釉原蛋白（amelogenin X-linked，Amelx）在亚群16、17中强表达，上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Epcam）在亚群10、17、24中强表达（ 图2 ）。

2.牙髓细胞的分区图谱：牙髓细胞再次聚类分析结果显示，牙髓细胞仍然分为5个相连的细胞亚群（亚群0~4， 图3A ）。细胞周期分布显示，亚群2主要处于G2/M期和S期，其他4个亚群多处于G1期（ 图3B ）。

图3 小鼠牙髓细胞的聚类分析及体内定位  A：牙髓细胞的统一流形逼近和投影（UMAP）图（每个点代表1个细胞，不同颜色代表不同亚群，数字为亚群序号）；B：牙髓细胞的细胞周期分布；C~G：牙髓细胞各亚群标记基因在UMAP图上的表达（上图）和体内原位杂交染色（下图）结果，箭头示阳性信号为红色，蓝色示细胞核（Cxadr为柯萨奇病毒腺病毒受体，Smoc2为SPARC相关模块化钙结合蛋白2，Top2a为Ⅱ型DNA拓扑异构酶，Notum为棕榈酰蛋白羧酸酯酶，Dspp为牙本质涎磷蛋白）；H：7 d小鼠磨牙牙髓的分区模式图谱（不同颜色代表不同细胞亚群，数字为亚群序号）

图4 小鼠磨牙牙髓细胞的基因表达热图

3.牙髓细胞的发育轨迹：见图5 。0、3、7 d 3个时点的牙髓UMAP图及细胞数量统计显示，亚群0成熟牙髓细胞比例逐渐增多，亚群1牙乳头细胞变化不明显，而亚群2周期细胞、亚群3前成牙本质细胞和亚群4成牙本质细胞的比例逐渐减少（ 图5A ，D）。拟时序分析显示，牙髓细胞有1个发育起点，位于亚群1，发育轨迹经过亚群2后，分化为2个发育终点，分别位于亚群0和亚群4（ 图5B ）。小鼠磨牙牙髓细胞发育轨迹模式图显示，牙髓细胞的发育从Smoc2+的牙乳头细胞出发，经过增殖（Top2a+周期细胞），分化出两条不同的发育方向，一是向Cxadr+的成熟牙髓细胞分化，二是经过Notum+的前成牙本质细胞，向Dspp+的成熟成牙本质细胞分化（ 图5C ）。

图5 小鼠磨牙牙髓细胞发育的动态变化分析  A：0、3、7 d牙髓细胞各自的统一流形逼近和投影（UMAP）图；B：拟时序分析显示牙髓细胞的发育轨迹（空心1为起点，实心1、2为终点）；C：牙髓细胞发育轨迹模式图；D：不同发育阶段牙髓细胞的比例分析；E：小提琴图，显示亚群0、2的标记基因柯萨奇病毒腺病毒受体（Cxadr）和Ⅱ型DNA拓扑异构酶（Top2a）在不同发育时期的表达水平变化

小提琴图显示，Cxadr的表达集中在亚群0，表达水平随着牙齿发育明显上升；Top2a的表达集中在亚群2，表达量逐渐下降（ 图5E ）。原位杂交结果显示（ 图6 ），Smoc2在胚胎期16.5 d遍布整个牙乳头；在0 d分布于牙胚下部；在7 d时，仅局限于根尖部（ 图3D ）。Notum在0 d时遍布整个成牙本质细胞层，此时Dspp的表达尚不明显且分散；在3和7 d时Notum逐渐向根方的上皮根鞘附近集中（ 图3F ， 图6 ），而冠部的成牙本质细胞层出现Dspp强阳性表达（ 图3G ， 图6 ）。

图6 不同发育时期小鼠下颌第一磨牙的原位杂交染色图（红色示阳性信号，蓝色示细胞核）A：胚胎期16.5 d（E16.5 d）牙乳头细胞标记基因SPARC相关模块化钙结合蛋白2（Smoc2）染色；B：0 d Smoc2染色；C：0 d前成牙本质细胞标记基因棕榈酰蛋白羧酸酯酶（Notum）染色；D：3 d Notum染色；E：0 d成牙本质细胞标记基因牙本质涎磷蛋白（Dspp）染色；F：3 d Dspp染色

4.牙髓细胞的功能分析：见图7 。各亚群主要的生物学过程和分子功能的基因本体分析注释结果显示，亚群0（成熟牙髓细胞）主要与成骨、矿化和细胞外基质结构相关，具备与多种胞外分子结合的能力（ 图7A ）；亚群1（牙乳头细胞）主要与“细胞外结构组织”和器官发育相关（ 图7B ）；亚群2（周期细胞）的主要功能都与有丝分裂相关（ 图7C ）；亚群3和4为成牙本质细胞系亚群，功能皆与生物矿化和细胞外基质结构相关（ 图7D ，E）。成熟牙髓细胞和成牙本质细胞在功能上相近，不同之处在于成熟牙髓细胞具有细胞-基质黏附功能和硫化物结合能力，成牙本质细胞具有胶原纤维组织功能、双加氧酶活性和L-抗坏血酸结合能力。

图7 小鼠磨牙牙髓细胞不同亚群的基因本体分析结果  A：亚群0；B：亚群1；C：亚群2；D：亚群3；E：亚群4

随着单细胞测序技术的广泛应用，人类对器官发育和疾病发生、发展的认知站上了新台阶。单细胞测序技术于2018年开始应用于口腔研究，Takahashi等^［ 8 ］借助scRNA-seq发现小鼠牙囊中的甲状旁腺激素相关蛋白标记间充质干细胞，通过自分泌作用调控细胞命运。Sharir等^［ 9 ］通过scRNA-seq，发现小鼠切牙上皮干细胞处于活跃的细胞周期中，明确了干细胞在颈环中的定位和分化路径。目前的研究致力于绘制小鼠和人类牙齿的细胞图谱，揭示牙胚不同种类细胞间的调控和通讯网络^{［ 4 ， 10 , 11 , 12 ］}。现有研究通常是对单一发育阶段的牙齿进行scRNA-seq，难以在时间维度上对单个细胞的发育进行动态分析。本研究选取0、3、7 d 3个发育阶段的小鼠磨牙进行scRNA-seq。这期间牙胚迅速发育，细胞类型丰富、全面，更有助于发现细胞在发育过程中的动态变化规律。在未来的研究中，有必要对更早期和更晚期的牙齿进行scRNA-seq，以完善牙齿发育全周期的细胞图谱绘制。

为方便叙述，本文中的牙髓细胞包括牙乳头细胞、成牙本质细胞和成纤维细胞。牙髓由牙乳头发育而来，二者在组织学上无明显界限^{［ 13 , 14 ］}。本研究发现牙髓和牙乳头在转录组水平具有明显差异，参与的生物学过程也显著不同，为揭示二者的异质性和功能提供了可靠依据。牙乳头细胞的基因功能主要与器官发育相关，说明牙乳头细胞处于分化早期，且它的细胞周期位于G1期，这些结果都与其间充质干细胞的身份相符^［ 15 ］。本研究发现Smoc2标记小鼠牙乳头细胞，这与既往研究中人根尖牙乳头细胞高表达Smoc2的结果一致^［ 16 ］。Smoc2还是小肠干细胞的体内标志物^［ 17 ］，提示Smoc2与干细胞功能密切相关。Smoc2与骨骼、牙齿的发育密切相关，Smoc2基因突变导致严重的缺牙和牙齿发育异常^{［ 18 , 19 ］}，具体机制还有待进一步探索。牙髓细胞中还存在一个周期细胞亚群，标记基因是Top2a，基因本体分析显示该亚群基因功能与有丝分裂相关，说明这群细胞在进行活跃的细胞增殖^［ 20 ］。在小鼠切牙和小肠等多种干细胞微环境中，都存在类似的处于活跃增殖状态的过渡放大细胞^{［ 17 ， 21 ］}。本研究显示Cxadr在小鼠成熟牙髓中高表达。Cxadr突变小鼠表现为多种致死性的发育缺陷^［ 22 ］，其在牙齿发育中的作用尚不明确。虽然成熟牙髓细胞和成牙本质细胞位于分化的两条路径上，但它们在功能上十分相近，成熟牙髓细胞的功能与成骨和矿化密切相关，这或许能解释为何外伤后的牙齿容易发生牙髓钙化^［ 23 ］。成牙本质细胞是只存在于牙髓的特异性细胞，其分子标志物的鉴定常用于判断牙髓干细胞的分化状态。目前的研究发现成牙本质细胞特异性表达Dspp、牙本质基质蛋白1、骨钙素等标志物^［ 24 ］。前成牙本质细胞是牙乳头细胞向成牙本质细胞分化的中间状态，其定位和特征尚不明确。在本课题组前期研究中，发现Notum作为前成牙本质细胞的标志物，在调节成牙本质分化中发挥重要作用^［ 2 ］。本研究通过原位杂交技术，对前成牙本质细胞和成牙本质细胞在不同发育时期的体内定位和相互关系进行精确测绘，并结合scRNA-seq完整绘制了它们的转录组图谱和发育轨迹，对研究其功能和牙髓干细胞的定向分化具有重要意义。

除了牙髓细胞，牙胚中还存在牙囊细胞、上皮细胞、免疫细胞、管周细胞、内皮细胞、胶质细胞等一系列重要的细胞类型。牙囊细胞和上皮细胞的细胞图谱和发育轨迹已被初步阐释^{［ 9 ， 25 , 26 ］}。牙源性干细胞是组织工程常用的种子细胞，目前的研究发现常用的牙源性干细胞标志物，如Cd90、Cd105、Cd146等，在体内定位于管周细胞和内皮细胞，而非牙髓细胞^［ 27 ］。本研究中牙髓细胞的DEG也未发现这些标记基因，提示在发育和稳态维持过程中，干细胞的来源可能不同。目前牙胚中免疫细胞的图谱和功能尚不明确，不同研究中免疫细胞的种类及数量差别较大，还有待进一步深入研究^{［ 4 ， 11 ］}。

综上，本研究借助scRNA-seq技术，揭示了小鼠磨牙的细胞图谱和标记基因，从时间和空间两个维度绘制了牙髓细胞的发育图谱，并对牙髓细胞各亚群的功能进行了初步分析，研究结果可为阐明牙齿的发育过程和调控机制提供参考，为临床实现牙髓损伤修复和牙髓再生提供依据。