S.albusB4是从S.albusJ1074衍生而来的一种优良的天然化合物生产底盘。因此，选择它作为构建(R)-(−)-mellein生物合成代谢途径的初始菌株（图1）。pks8在pIB139质粒中过表达，由PermE启动子驱动。将获得的重组菌株B4mel01和S.albusB4在发酵培养基中培养72小时，然后用HPLC或HRMS-TOF进行分析。HPLC结果显示，B4mel01中出现了一个保留时间为19.2分钟的新峰，而S.albusB4中未检测到该峰。该峰的保留时间与标准的保留时间一致（图2A）。经HRMS测定，新化合物在正离子模式下的质荷比为m/z 179.0703，与(R)-(−)-mellein的[M+H]+相同（−0.4 ppm误差）（图2B）。此外，通过比较产品的旋光度与标准的旋光度，确定了C3处的R构型。这些结果表明，目标产物在B4mel01菌株中成功合成，并证明了在S.albus中表达S.erythraea的PKS编码基因的适宜性。
图1 S.albusB4中(R)-(−)-mellein生物合成途径示意图
在启动子PermE的作用下，B4mel01发酵72小时后仅获得20.9 mg/L的(R)(−)-mellein（图2C），作者推测这是启动子不合适导致的。因此，作者评估了除了PermE之外的PkasO28和Pj2311929强启动子。通过对重组菌株的RFU/OD600定量来评估三个候选启动子的强度。结果发现，启动子强度如下：PermE<PkasO<Pj23119（图3A）。接下来，作者分别使用PkasO和Pj23119在底盘S.albusB4中过表达pks8。比较3株重组菌株(R)-(−)-mellein滴度，48小时后，B4mel03菌株的(R)-(−)-mellein滴度明显高于其他2株菌株，达1248.2mg/L，而B4mel01和B4mel02菌株的(R)-(−)-mellein滴度分别仅为28.8mg/L和64.5mg/L（图3E）。作者进一步分析了pks8的转录水平。如图3B所示，pks8的转录水平在三种菌株中B4mel03中最高。
图2 S.albusB4中(R)-(−)-mellein的从头生物合成
图3 通过在S.albusB4底盘中过表达pks8来增加(R)-(−)-mellein的产量
底盘链霉菌中生物合成基因簇（BGC）的异源表达一般采用基于phiC31的整合载体，如pIB139、pSET152等，由于这些载体可以整合到受体菌株基因组的attB位点中，因此整合更多的基因组attB位点可以增加基因簇在异源宿主中的拷贝数。对于S.albusJ1074，染色体上存在一个典型的phiC31attB位点和一个伪attB位点，整合到伪attB位点的效率远低于整合到典型的位点。由于伪attB位点已被phiC31attB位点取代，另外两个额外的噬菌体phiC31attB位点在S.albusB4底盘中实现染色体整合，21Pj23119驱动的4个pks8拷贝分布在B4mel03的染色体上。同样地，作者将pmE04转到S.albusB4中，构建了含有8个pks8拷贝的菌株B4mel04。结果发现，pks8的复制导致(R)-(−)-mellein产量略有增加（4.96%），约为1310.2 mg/L（图4D）。进一步分析了pks的转录水平。pks8的转录水平在第4天和第6天分别因基因复制而增加32.4%和134.4%（图4A）。
图4 通过在S.albusB4底盘中增加pks8拷贝数来增加(R)-(−)-mellein产量
作者选取了两种来自不同放线菌的ACC（XNR_4211和SACE_0028）进行测试。如图5A所示，与XNR_4211相比，SACE_0028在(R)-(−)-mellein生产细胞工厂中表现出更优的性能。引入XNR_4211后，(R)-(−)-mellein产量下降，B4mel05菌株生长严重迟缓（图5A）。相反，B4mel06中的(R)-(−)-mellein滴度达到1615.2 mg/L，比B4mel04菌株高23.3%（图5D）。在大肠杆菌中也观察到了类似的情况，其中野生大肠杆菌ACC的过表达影响了细胞活力，而异源间苯三酚产量根本没有提高。相反，在相同的大肠杆菌菌株中过表达谷氨酸棒状杆菌的ACC导致细胞内丙二酰辅酶A浓度增加3.1倍，从而使间苯三酚产量提高2.2倍。
图5 通过ACC过表达增加(R)-(−)-mellein产量
在细菌中，长链脂肪酸经β-氧化生成乙酰辅酶A，该过程依次由脂肪酰辅酶A合酶、长链酰基辅酶A脱氢酶、烯酰辅酶A水合酶、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶和乙酰辅酶A乙酰转移酶催化（图1）。为了增强(R)-(−)-mellein合成途径的乙酰辅酶A前体供应，作者尝试在产生(R)-(−)-mellein的S.albus中改造β-氧化途径。通过KEGG搜索S.albusJ1074通路图谱，发现参与β-氧化途径的内源基因。选择了XNR_0643（fadD，编码脂肪酰基辅酶A合酶）、XNR_0302（fadE，编码长链酰基辅酶A脱氢酶）、XNR_0150（fadB，编码烯酰辅酶A水合酶）和XNR_1438（fadA，编码乙酰辅酶A乙酰转移酶）进行测试。结果发现，XNR_0643比B4mel04提高了24.5%，XNR_0302提高了14.5%，XNR_0150提高了25.3%，XNR_1438提高了22.1%（图6D），表明β-氧化基因是调节短链脂肪酰辅酶A水平以生产聚酮化合物的良好靶点。
图6 通过改造β-氧化途径提高(R)-(−)-mellein产量
基于以上结果，作者将β-氧化途径相关基因与SACE_0028组合，将Pj23119-fadD-fadE-fadB-fadA和Pj23119-fadA-fadB-fadE-fadD基因盒分别引入B4mel06染色体。如图7C所示，B4mel11比B4mel06提高了24.8%，滴度为2016.4 mg/L，B4mel12提高了34.9%，滴度为2178.8 mg/L。
图7 通过共同过表达参与β-氧化途径和SACE_0028的基因来增加((R)-(−)-mellein产量
生长曲线表明，在发酵后期，所有(R)-(−)-mellein生产菌株的生物量明显低于S.albusB4，但B4mel01和B4mel02除外，其合成的(R)-(−)-mellein较低（图3-7）。值得注意的是，所有(R)-(−)-mellein生产菌株的培养基中葡萄糖残留量在30至45 g/L之间，但B4mel01、B4mel02和S.albusB4除外，在发酵结束时几乎完全耗尽了葡萄糖（60 g/L）（图3-7）。作者推测，高浓度(R)-(−)-mellein对底盘生长产生了毒性。作者尝试通过微孔树脂原位吸附来解除((R)-(−)-mellein对B4mel12的抑制，在发酵培养基中添加吸附树脂AmberliteXAD16，结果发现微孔树脂的添加使得发酵后期B4mel12的葡萄糖消耗速度明显加快，发酵结束时培养基中的葡萄糖已基本耗尽（图8）。在发酵后期添加吸附树脂AmberliteXAD16，B4mel12菌株生物量显著增加，(R)-(−)-mellein产量达到6395.2 mg/L，为迄今为止报道的(R)-(−)-mellein最高产量。
图8 添加吸附树脂Amberlite XAD16后B4mel12菌株的生长、葡萄糖消耗及(R)-(−)-mellein含量的发酵曲线
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https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c02463
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摘译 | 胡方林
编辑 | 王咏桐
左莎莎
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