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|摘要
获取骨组织的冰冻切片以供术中检查具有挑战性。因此，为了确定切除的骨边缘，骨科肿瘤学家依靠术前的X射线计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）。
然而，这些技术不允许进行准确的诊断或术中确认肿瘤边界，并且在骨肉瘤中，它们可能导致骨边缘比必要的宽达10倍（体积上达1000倍）。
在这里，作者展示了一种通过反射模式下的紫外光声显微镜实时三维轮廓扫描组织的方法，可用于术中评估未脱钙和脱钙的厚骨样本，而无需进行组织切片。通过传统光学显微镜获取的金标准苏木精和伊红染色组织病理学图像验证了该技术，并且还表明，一种无监督的生成对抗网络可以虚拟染色紫外光声显微镜图像，从而使病理学家能够轻松识别癌变特征。通过紫外光声显微镜实现的无标记和无需玻片的组织病理学检查，可能允许快速诊断骨组织病理状况，并有助于术中确定肿瘤边界。
学术地址：
https://www.nature.com/articles/s41551-022-00940-z
代码地址：
https://github.com/junyanz/pytorch-CycleGAN-and-pix2pix
|前世今生
2018年全球大约有1810万例新的癌症病例被确诊，而预计到2040年，每年的新发癌症病例将达到2950万例，同时伴有960万例癌症相关死亡。尽管癌症治疗取得了进展，手术仍然是基石，超过80%的癌症患者在其疾病进程中某个时刻会接受手术治疗。在肿瘤外科手术中，术中病理检查提供了手术指导并帮助识别肿瘤边界。在肿瘤手术中，为了确保阴性边缘（意味着切除的肿瘤周围是正常组织），通常会对切除组织的边缘进行术中冷冻切片检查。大部分具有阴性边缘切除的局部肿瘤显示出更好的预后，并且肿瘤复发的机会较低。术中肿瘤边界的评估使得肿瘤外科医生能够在关闭手术伤口之前确认肿瘤的完全切除，并帮助患者避免第二次肿瘤切除手术。
为了提供快速的病理检查并指导肿瘤切除，肿瘤外科医生目前依赖于冷冻切片技术，这通常需要取一小部分组织并在低温冷冻机中冷冻组织。然后使用显微切片机或低温切片机将冷冻组织切成薄片（5-8 µm），并染色以便在显微镜下直接检查。然而，由于需要将标本切成薄片，使得这种技术无法用于硬组织，并且也可能不可避免地造成组织损失。例如，由于骨化的原因，对于钙化骨（如皮质骨和钙化肿瘤）的快速病理检查通常无法通过冷冻切片技术来完成。通常情况下，不可能直接将未脱钙的骨组织切成足够薄的切片来进行传统的病理检查。相反，骨组织必须经过一个可能需要几天时间的脱钙过程，如果脱钙不足或过度脱钙则可能会引入伪影。
骨标本的快速病理检查困难一直是骨肿瘤外科医生在医疗实践中长期面临的挑战。对于切除原发性骨肿瘤的骨肿瘤外科医生来说，由于需要耗时的脱钙程序，通常无法在手术期间进行病理分析。因此，外科医生倾向于根据术前影像而不是术中组织分析来确定更广泛的边缘。虽然更广泛的边缘有利于局部肿瘤控制，但如果这些边缘包含肌腱、神经、血管或关节等重要结构，则功能丧失可能会更大。许多外科医生将2厘米视为理想的骨边缘，并以此作为术前影像测量的标准，而一项在2019年进行的荟萃分析显示，2毫米的边缘就足以防止局部复发。鉴于像骨肉瘤这样的钙化原发性骨肿瘤大多发生在关节周围的位置，1.8厘米的边缘差异可能导致保留关节、增加未来可能需要的任何手术所需的患者骨存量以及减少并发症。能够在肢体保留手术中快速准确地分析骨边缘的方法将是一种宝贵的工具。
近年来，成像技术的快速发展已经革新了许多生物学、生物医学领域以及病理学。多种荧光显微镜方法已被证明适用于诊断成像，包括共聚焦显微镜、广域结构照明显微镜（SIM）、光片显微镜以及具有紫外线表面激发的显微镜（MUSE）。然而，这些荧光显微镜技术需要对标本进行染色以提供图像对比度，这涉及复杂的、针对不同样品在成像前的处理步骤，并且需要高度熟练的人员。此外，还开发了快速病理诊断的无标记光学成像技术，如受激发拉曼散射显微镜（SRS）和相干断层扫描/显微镜（OCT/OCM）。然而，尽管MUSE和SRS技术提供了无滑片标本的快速表面成像，但它们缺乏深度分辨能力，并且由于有限的景深而导致未加工无滑片标本的不平整表面出现模糊图像。基于去卷积的图像融合和多层z叠图像可以用来实现扩展的景深。然而，这通常需要更长的成像时间，并且需要仔细的相机校准和繁琐的点扩散函数实验测量，这对噪声或图像变化非常敏感。虽然OCT具有深度分辨能力，但由于光学散射对比度没有足够的色素特异性，因此不能提供组织内的直接核对比度。因此，OCT图像不能很好地匹配目前苏木精和伊红（H&E）染色的病理标准，限制了其作为病理诊断工具的应用。不同成像方式和传统病理方法的比较见补充表1。
在手术中切除的钙化骨肿瘤难以实现平整，因为切割坚硬的钙化骨必然会导至粗糙表面。为了解决这些问题，开发了实时三维（3D）轮廓扫描紫外光声显微镜（UV-PAM），并演示了厚未加工骨的无标记成像，这只需要最小限度的组织准备。对未切片骨标本的成像能力允许直接可视化良好保存的钙化结构和成分，这使得UV-PAM有可能成为如厚钙化骨标本等挑战性组织快速诊断的理想工具。作为一种混合成像方式，光声断层扫描（PAT）通过光吸收检测内源性或外源性对比引起的超声信号。波长依赖的吸收使PAT能够定量测量不同光学吸收体的浓度和分布，而较少散射的超声检测则实现了高分辨率的深层组织成像。可扩展的空间分辨率和成像深度的独特优势使得PAT在各种应用中具有吸引力，从纳米尺度的线粒体成像到深层组织中的毫米级血管。基于成像分辨率和重建方法，PAT可以以光声计算机断层扫描（PACT）或光声显微镜（PAM）的形式实现。虽然PACT主要用于超声分辨率的深层组织成像，但PAM通常以光学衍射极限分辨率实施。利用非线性吸收或格吕内森参数，PAM还可以实现超越光学衍射极限的超分辨率成像。根据照明波长，无标记PAM已成像了多种对比度，包括但不限于血红蛋白、DNA/RNA、细胞色素、水、脂质和蛋白质。
在本研究中，作者报告了使用266纳米纳秒脉冲激光的UV-PAM系统的开发，并展示了其在骨标本类似组织学成像中的应用。实施了实时三维轮廓扫描机制，以确保对于不平整的骨标本表面有一致的和光学衍射极限分辨率，而不需要事先知道表面轮廓。利用UV-PAM系统，展示了具有粗糙表面的厚未加工骨标本的类似组织学成像，这对于传统组织学技术来说是难以实现的。获得了未脱钙和脱钙骨切片的UV-PAM图像，并与金标准H&E组织学图像进行了比较验证。此外，提出了一种基于无监督深度学习的方法来进行灰度UV-PAM图像的虚拟H&E染色，以提供互补的对比度并帮助病理学家解释PAM图像。不同于生成对抗网络（GAN）等监督深度学习方法，基于循环一致性生成对抗网络（CycleGAN）的无监督深度学习方法不需要染色和未染色图像的配对。这避免了由于样本准备引起的形态学变化导致的用于神经网络训练的UV-PAM和H&E组织学图像对齐的需求。
|匠心独运
图1：通过深度学习实现快速无标记紫外光声组织学检查。a, 三维轮廓扫描紫外光声显微镜（UV-PAM）系统的示意图。紫外激光经过带通彩色玻璃滤光片（BF）进行光谱过滤，并使用一对透镜和针孔（PH）进行空间过滤和扩展。分束器（BS）放置在透镜前，用于拾取一小部分光束以供光电二极管测量，以补偿激光脉冲间的能量波动。准直和扩展后的光束通过定制的水浸物镜聚焦，并穿过环形超声换能器照射样本，以激发光声效应。放置在样本架上的样本进行三维轮廓扫描以实现UV-PAM成像。b, 用于PAM图像虚拟染色的深度学习网络架构。CycleGAN模型由两个生成器组成，G: PA→H&E 和 F: H&E→PA，以及相应的对抗判别器，DPA 和 DHE。c, 骨样本的光声组织学检查流程和传统H&E染色组织学检查流程（1×1 mm² 视场）。
|卓越性能
图2：厚（>1厘米）未加工骨样本的无标记三维轮廓扫描紫外光声显微镜（UV-PAM）。a-d, 从患有类似骨纤维发育不良样的牙源性瘤患者身上提取的未脱钙左胫骨的UV-PAM图像，通过二维光栅扫描（a）和三维轮廓扫描（c）获得，展示了三维轮廓扫描对具有粗糙表面的未脱钙骨样本改善图像质量的效果。比例尺，500 µm。在二维光栅扫描（b）和三维轮廓扫描（d）过程中，通过光声信号的飞行时间信息计算出样本表面相对于光学焦平面在轴向方向上的位置轮廓。e-f, 同样对一个正常的未加工厚骨样本使用二维光栅扫描（e）和三维轮廓扫描（f）成像并进行比较。比例尺，250 µm。
图3：脱钙骨样本的无标记紫外光声显微镜（UV-PAM）检查。a, 一张附在玻璃载玻片上的脱钙非肿瘤性骨碎片的PAM图像。可以看到图像中间部分有一个几乎垂直定向的松质骨细梁。比例尺，500 µm。b, 图像左侧边缘显示的一部分松质骨的放大图像。比例尺，100 µm。c, 一张带有肺源性低分化腺癌转移灶的脱钙骨样本的FFPE（甲醛固定石蜡包埋）PAM图像，在玻璃载玻片上显示了转移性癌的肿瘤性腺体轮廓。比例尺，500 µm。d, c图的放大图像显示了转移性癌的巢状结构和腺体轮廓。比例尺，100 µm。
图4：用于识别脱钙骨碎片中肿瘤的无标记紫外光声显微镜（UV-PAM）。a, 一张带有转移性腺癌的脱钙骨切片的PAM图像。b, 一张带有正常骨碎片和造血骨髓的脱钙骨切片的PAM图像。为了更好地比较，将PAM对比度反转，以深色突出显示高吸收区域。c,d, 对应于a和b的H&E染色图像。在a和c中，转移性癌的肿瘤性腺体用红色箭头标出。比例尺，500 µm。
