伦敦卫生与热带学院：VP2 结构对抗原性的影响：BTV1 与高毒力 BTV8 血清型的比较

蓝舌病毒（BTV）是一种重要的虫媒病毒，对农业和经济产生重大影响，它能够引起绵羊和其他家畜及野生动物的严重疾病和死亡。尽管存在多种BTV血清型，但它们表现出独特的中和抗体反应，这些反应主要针对外层衣壳蛋白VP2。VP2是BTV血清型的主要决定因素，但血清型特异性的免疫反应限制了开发广谱预防性BTV疫苗候选物的可能性。尽管VP2是BTV的主要血清型决定因素，但其结构基础尚未得到研究。

在研究中，一组13种小鼠单克隆抗体和1种针对BTV1的重组VP2蛋白的兔多克隆抗体被评估了其与BTV1的同源反应性。这些抗体都通过间接ELISA检测与BTV1 VP2结合，显示出不同的反应范围和强度。其中，MAb 1B5和MAb 8D3展示了最低和最高的50%结合浓度，分别为0.069 µg/mL和0.00023 µg/mL。在血凝抑制（HI）试验中，除了MAb 2A2未能展现任何抑制活性外，所有抗体均能在1 µg/mL或更低的浓度下抑制血凝活性。然而，为了达到100%的抑制效果，多数抗体需要比ELISA检测的50%结合浓度高得多的抗体浓度。只有两种抗体，兔多克隆抗体和MAb 4A11，展现了对BTV1的中和活性。

图1.BTV1 抗 VP2 抗体组的同源反应性

2.VP2 氨基酸序列决定异源 BTV 血清型的差异抗原性

在研究中，分析了BTV1、BTV8和BTV10的VP2蛋白的氨基酸序列，以探究它们在结构上的差异如何影响它们与抗体的异源反应性。BTV1和BTV8的VP2蛋白之间存在显著的序列差异，这些差异可能决定了它们对抗体的异源反应性。通过间接ELISA检测，发现两种抗体（兔多克隆抗体和MAb 5C11）能够识别并结合BTV8和BTV10的VP2蛋白。特别是MAb 5C11对BTV1、BTV8和BTV10的VP2蛋白展现了高度保守的表位识别，表明其结合的表位在这三个血清型中高度保守。而兔多克隆抗体对异源VP2蛋白的结合浓度比对BTV1的同源VP2蛋白的结合浓度要高几倍，这表明其识别的表位在不同血清型之间存在差异。研究结果强调了VP2氨基酸序列在决定BTV血清型的异源抗原性中的重要作用。

图2.异源 VP2 序列分析和 BTV1 抗 VP2 抗体的反应性

3.异源 VP2 同源性模型预测具有潜在抗原影响的结构差异

在这项研究中，通过构建异源BTV1、BTV8和BTV10的VP2蛋白的同源模型，研究者们预测了这些模型之间可能存在的结构差异，并探讨了这些差异对抗原性可能产生的影响。通过将BTV8和BTV10的同源模型与BTV1的模型进行比对，研究者们发现在VP2蛋白的特定区域存在显著的结构差异。

对于BTV1和BTV8的比较，研究发现了三个区域的结构差异，这些区域位于VP2单体的中心、尖端和主体结构域。特别是，BTV8的VP2尖端结构域与BTV1相比，由于缺失了三个氨基酸（Arg209、Pro210和Gly211），导致了结构上的差异。

而BTV1和BTV10之间的比较则预测了九个结构差异区域，这些差异主要位于中心、发夹和主体结构域。这些预测的结构差异可能对抗原表位的构型和抗体的识别产生影响。

这些发现对于理解BTV不同血清型之间的抗原差异至关重要，并且可能有助于指导设计能够针对多个BTV血清型的疫苗。特别是，研究揭示了VP2尖端结构域在不同血清型之间可能存在关键的抗原表位，这些表位是中和抗体识别的潜在目标。

图3.预测代表 BTV1 和 BTV8 的同源模型之间的 VP2 结构的差异

图4.预测代表 BTV1 和 BTV10 的同源模型之间的 VP2 结构的差异

4.VP2 可以耐受尖端域的突变操作

在这项研究中，探讨了蓝舌病毒（BTV）VP2蛋白的尖端结构域（tip domain）对突变的耐受性。研究者们设计并构建了一系列VP2突变体，包括在BTV1和BTV8之间交换尖端结构域的突变体（1BB_8A & 8BB_1A）、在BTV1 VP2中将尖端结构域的带电残基替换为丙氨酸的突变体（LoopA_Ala）、在BTV1 VP2中删除特定氨基酸的突变体（DelΔ 209-11），以及在BTV8 VP2中插入这些氨基酸的突变体（InsΔ RPG）。

通过利用杆状病毒表达系统成功表达了这些突变体蛋白，并进行了纯化。通过Coomassie蓝染色和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析，确认了这些突变体蛋白的溶解性和纯度，并且证明了它们能够形成与野生型（WT）蛋白相当的二聚体和三聚体。

此外，通过反向遗传学方法成功拯救了携带这些VP2突变体的BTV1和BTV8病毒。单步生长曲线分析表明，这些突变病毒与相应的野生型病毒具有相似的生长表型。

这些结果表明，即使在BTV1和BTV8之间进行尖端结构域的互换这样的显著突变，VP2蛋白仍然能够耐受这些突变，并且保持其基本的结构和功能。这一发现对于理解VP2蛋白的结构与功能关系，以及指导设计针对多个BTV血清型的疫苗具有重要意义。

图5.VP2 尖端区域环 A 突变体

5.BTV1 的 A 环是抗 VP2 抗体的重要抗原靶点

在这项研究中，特别关注了BTV1的VP2蛋白的A环（loop A），这是病毒粒子表面一个重要的抗原位点。通过设计和测试具有A环突变的VP2蛋白，研究者们揭示了这一区域在抗VP2抗体识别中的重要作用。

研究中，通过构建具有特定突变的VP2蛋白，包括在BTV1背景中A环的替换（1BB-8A）、A环中带电残基突变为丙氨酸（LoopA_Ala）以及A环中特定氨基酸的缺失（DelΔ209-11），研究者们评估了这些突变对抗体结合能力的影响。

实验结果显示，几个单克隆抗体（MAbs）对这些A环突变体的结合能力发生了显著变化，表明A环对于这些抗体的识别至关重要。特别是，MAb 4A11，一种中和抗体，完全失去了与所有三种A环突变体的结合能力，这表明A环包含了对4A11抗体识别至关重要的表位。

此外，MAb 5C11，其识别的表位在BTV1、BTV8和BTV10中高度保守，也显示出对A环突变体的结合能力显著降低。然而，当这些突变体在BTV8背景中时，5C11的结合并未受到影响，这表明5C11抗体识别的表位在空间上可能靠近A环，但其结合并不直接依赖于A环的序列。

图6.BTV1 抗 VP2 抗体与环 A 突变体结合

6.抗 VP2 中和抗体靶向 BTV1 的 A 环

在这项研究中，研究者们发现抗VP2的中和抗体确实靶向了BTV1的A环。通过构建和测试A环突变体，研究者们揭示了A环在中和抗体识别中的重要性。

具体来说，研究者们发现：

1. 中和抗体兔多克隆抗体（Rab pAb）和单克隆抗体4A11能够中和BTV1，但是它们不能中和BTV8。

2. 当测试这些中和抗体对A环突变体的中和活性时，兔多克隆抗体仍然能够中和所有BTV1 A环突变体，但需要更高的抗体浓度。

3. 对于单克隆抗体4A11，其对BTV1 A环突变体的中和活性完全丧失，这表明A环包含BTV1型特异性的中和表位，且这些表位包括Arg209、Pro210和Gly211等关键残基。

此外，通过将先前研究中导致抗体介导的病毒中和能力丧失的VP2突变体的氨基酸残基位置与A环的位置进行比较，研究发现A环是BTV1、BTV10和BTV17等血清型中中和抗体表位的热点区域。

这些结果表明，A环是BTV1 VP2的一个重要的抗原决定簇，它包含了多个关键的中和抗体表位，这些表位对于BTV1的中和反应至关重要。这些发现有助于理解BTV的免疫保护机制，并可能对开发能够针对多个BTV血清型的疫苗产生影响。

图7.抗体浓度

图8.VP2 氨基酸残基的位置对于中和抗体识别至关重要

本研究通过比较BTV1和高毒力BTV8血清型的VP2结构，揭示了VP2尖端结构域的微小结构差异对抗原特异性有显著影响。研究发现，A环是中和抗体识别的热点区域，并且这些抗体主要靶向BTV1的A环。此外，即使在A环中引入显著的突变，如互换、缺失或丙氨酸替代，VP2蛋白仍然能够维持其基本结构和功能，显示出VP2对突变的耐受性。

研究结果表明，A环中的特定氨基酸对于BTV1的中和抗体识别至关重要，这些发现为理解BTV的免疫保护机制提供了新的见解。特别是，它们强调了设计能够诱导广泛中和反应的疫苗的重要性，这对于控制蓝舌病的爆发至关重要。

总之，这项研究不仅增进了我们对BTV VP2蛋白结构与功能关系的理解，而且为开发针对多个BTV血清型的广泛保护性疫苗提供了结构基础，有助于未来更有效的疫苗设计策略。

https://journals.asm.org/journal/jvi 

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