《食品科学》：广西科技大学任仙娥实验师：水力空化处理对大豆分离蛋白与儿茶素相互作用及结构功能特性的影响

在相同儿茶素质量浓度下，经水力空化处理后SPI与儿茶素的结合量较未处理组显著增加（P＜0.05）。当儿茶素质量浓度为2.0 mg/mL时，水力空化处理能将儿茶素与SPI的结合量由处理前的（21.82±0.18）mg/g提高至（62.55±0.36）mg/g。原因是水力空化产生的剪切力等空化效应使SPI的结构展开，暴露出更多的活性基团，促进儿茶素与蛋白质的结合，从而提高儿茶素与SPI结合量。此外，水力空化能够产生羟自由基，这些自由基一方面能使儿茶素氧化成醌，醌再与蛋白质氨基酸侧链中的氨基或巯基反应形成C—N或C—S键，促进蛋白质与儿茶素的共价结合；另一方面，这些自由基也能使蛋白质侧链上的氨基酸残基被氧化，然后蛋白质分子上的自由基通过C—N或C—S键与儿茶素反应，形成SPI-儿茶素共价结合物。

同时，在相同儿茶素质量浓度下，水力空化处理后的SPI-儿茶素复合物的紫外吸收强度高于未处理组，原因是水力空化使SPI的结构展开，埋藏在蛋白分子内部的酪氨酸和色氨酸等发色基团暴露；同时，水力空化促进了蛋白质与儿茶素之间的结合，使二者间的作用力增强，SPI的构象发生变化，从而引起紫外吸收强度的变化。

在激发波长290 nm下，色氨酸残基可在300～400 nm的发射波长中产生荧光。色氨酸残基荧光强度的变化反映蛋白质构象的变化，因此可以表征蛋白质三级结构的变化。由图4可知，添加儿茶素后，SPI-儿茶素复合物的荧光强度降低，且随着儿茶素质量浓度的增加，荧光强度逐渐降低。发生这一现象的原因是蛋白质与儿茶素相互作用后，改变了蛋白质的空间构象，使色氨酸残基的包埋程度增加，导致蛋白质的荧光猝灭。同时，添加儿茶素后，蛋白质的最大吸收峰发生红移，这是因为儿茶素是一种极性很强的分子，使色氨酸残基周围的微环境发生改变，变得更加亲水，从而表现出明显的红移现象。另外，经水力空化处理后，复合物的峰强度降低和红移现象较未处理组更加明显。这是因为水力空化处理促进了SPI与儿茶素的相互作用，使SPI结合了更多的儿茶素，导致荧光光谱的变化更明显。

巯基和氨基对维持蛋白质分子的稳定性至关重要，还可能影响蛋白质的功能特性。由表1可知，随着儿茶素质量浓度的增加，SPI-儿茶素复合物的游离巯基和游离氨基含量显著降低（P＜0.05）。由于在测定游离氨基和巯基时使用了可以破坏非共价键的变性剂，如尿素和十二烷基硫酸钠，因此游离巯基和游离氨基含量的降低主要归因于儿茶素与SPI在空气中有氧的条件下通过C—N键和C—S键的共价结合。

在相同儿茶素质量浓度下，与未处理的SPI-儿茶素复合物相比，经水力空化处理的复合物游离巯基和游离氨基含量更低，其原因可能是由于水力空化能促进羟自由基的产生，因此，SPI中更多的游离巯基和氨基会被羟自由基氧化，使SPI成为活性蛋白，通过C—N键和C—S键与更多的儿茶素共价结合，导致游离巯基和游离氨基含量降低更多。

由图6可知，添加儿茶素后，未经水力空化处理的SPI-儿茶素复合物的平均粒径显著减小（P＜0.05），且随着儿茶素质量浓度的增加，复合物的平均粒径显著减小（P＜0.05），这是由于未经水力空化处理的儿茶素与SPI间的相互作用增强，儿茶素与SPI主要以静电相互作用、疏水相互作用、氢键等非共价的方式结合，形成了比较紧密的结构，从而使平均粒径减小。这与Dai Shicheng等的研究结果一致，蛋白质与儿茶素结合，复合物的平均粒径减小。纯SPI经水力空化处理后平均粒径显著减小（P＜0.05），原因是水力空化产生的剪切力或冲击波等空化效应能破坏蛋白质分子间的相互作用，使大聚集体解聚，粒径减小。但是在添加儿茶素后，随着儿茶素质量浓度的增加，复合物平均粒径显著增加（P＜0.05），发生这一现象的原因是水力空化产生羟自由基，使SPI与儿茶素反应形成共价复合物，形成大聚集体，复合物的平均粒径增大。

Zeta电位与蛋白质表面的电荷强度有关，反映静电排斥或静电吸引的强度。由图7可知，所有样品都带有负电荷，这是因为SPI带有大量负电荷。纯SPI经水力空化处理后Zeta电位绝对值显著降低（P＜0.05），这说明水力空化处理使得蛋白质分子发生破碎，改变了蛋白质分子的电荷分布，蛋白质内带正电荷的氨基酸（如赖氨酸、精氨酸）暴露，中和了蛋白质表面的负电荷。随着儿茶素质量浓度的增加，复合物的Zeta电位绝对值显著增加（P＜0.05），其原因是儿茶素可以通过氢键和疏水相互作用等非共价键与SPI结合，也可以通过C—N键或C—S键等共价键与SPI结合，而儿茶素本身带有负电荷，所以添加儿茶素增加了复合物所带的负电荷。

由表2可知，添加儿茶素使SPI-儿茶素复合物的α-螺旋和β-转角相对含量增加，β-折叠相对含量减小，无规卷曲无明显变化。这说明SPI与儿茶素相互作用后在一定程度上改变了蛋白质的二级结构，诱导多肽链二级结构单元间氢键发生重排，使蛋白质结构松动。这一结果与Zhou Siduo等研究结果相似，该研究发现表没食子儿茶素没食子酸酯作用于SPI，使α-螺旋、β-转角和无规卷曲相对含量增加，β-折叠相对含量减小。但是，金花等研究发现，绿原酸作用于黑豆蛋白导致α-螺旋相对含量减小、无规卷曲相对含量增加。二级结构变化不一致主要是由于蛋白质和多酚的结构和种类不同，相互作用位点和模式也不同所导致的。

同时，在相同儿茶素质量浓度下，与未处理组相比，水力空化处理后SPI-儿茶素复合物α-螺旋、β-转角和无规卷曲相对含量增加，β-折叠相对含量减小。这一结果是因为空化效应使得蛋白质结构展开，蛋白质与儿茶素之间的结合强度高于未经水力空化处理的强度，因此对蛋白质结构的影响更加显著。

此外，在相同儿茶素质量浓度下，水力空化处理后的SPI-儿茶素复合物的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率以及铁离子还原能力显著高于未处理组（P＜0.05），当儿茶素添加量为2.0 mg/mL时，DPPH自由基清除率由处理前的（48.64±1.24）%上升至（84.72±0.12）%，ABTS阳离子自由基清除率由（35.60±1.21）%上升至（75.51±0.79）%，铁离子还原能力由0.81±0.02上升至1.52±0.05。这是因为经水力空化处理的复合物具有更高的儿茶素结合量，引入了更多的酚羟基，发挥出更强的抗氧化活性。

水力空化产生的剪切作用能使SPI的分子结构展开，暴露出更多的结合位点，同时水力空化能够产生羟自由基，这些自由基能使儿茶素氧化成醌，也能使蛋白质侧链上的氨基酸残基被氧化，促进儿茶素与SPI之间的共价相互作用，从而使更多的儿茶素与SPI结合。通过紫外吸收光谱、荧光光谱和圆二色光谱分析，证实水力空化处理能促进SPI-儿茶素复合物的形成，并使复合物的二级结构中α-螺旋、β-转角和无规卷曲相对含量增加，β-折叠相对含量减小。同时，由于更多儿茶素的引入，经水力空化处理后的SPI-儿茶素复合物表现出更低的表面疏水性和游离氨基、巯基含量以及更高的抗氧化活性。可见，水力空化可作为一项有效的技术用于功能性食品蛋白质的开发。所制备的SPI-儿茶素复合物可用于构建抗氧化型乳液，实现食品中脂溶性易氧化营养与功能成分的有效载运与可控释放。

另外，本研究虽然通过紫外光谱、荧光光谱和圆二色光谱等技术对SPI-儿茶素复合物的二级和三级结构进行表征，但是这些技术尚不能确定SPI与儿茶素之间具体的结合位点，下一步研究将通过分子模拟与对接技术来确定二者的结合位点，以更好地揭示它们之间的相互作用。