【文献阅读041】PSC患者中NK细胞CD57表达降低与细胞毒性增强有关

背景/目的：原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种慢性炎症性胆道疾病，其免疫病理基础仍然是一个谜。自然杀伤细胞（NK）是先天免疫的关键组成部分，在不同的自身免疫性疾病（AIDs）中似乎发挥着多种作用。本研究的目的是确定NK细胞在PSC发病机制中的作用。

方法：系统地检测大量PSC患者和健康对照（HC）中循环NK细胞的频率和表型。此外，还研究了NK细胞的功能，包括细胞毒性和细胞因子的产生。

结果：PSC患者中CD3⁻CD56^dimCD16⁺（定义为CD56^dim）NK细胞的频率明显低于HCs。来自PSC的CD56^dim NK细胞表现出更不成熟的表型，包括自然杀伤受体NKp46的高表达和高度分化的NK细胞标志物CD57的下调。有趣的是，NK细胞CD57表达的降低与PSC的疾病严重程度相关。此外，与HCs相比，PSC CD56^dim NK细胞针对靶细胞的CD107a脱粒和细胞溶解活性增加。进一步分析表明，与CD57⁺CD56^dim NK细胞相比，来自PSC的CD57⁻CD56^dim NK细胞具有更高的NKp46、NKp30、IL-2受体和KLRG1的表达，并且具有更高的细胞毒性。

结论：我们的数据表明，PSC NK细胞分化失调，细胞毒活性增强。这种变化可能在功能上参与了发病机制和疾病进展，从而推断了NK定向免疫治疗PSC的潜力。

原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种肝内和肝外胆管的慢性自身免疫性疾病，经常与炎症性肠病（IBD）相关。尽管有大量关于PSC的流行病学、自然史和遗传关联的数据，但其免疫病理机制仍不明确。自然杀伤细胞（NK）是先天免疫系统的重要效应细胞，通过快速杀伤异常细胞和产生大量细胞因子和趋化因子，在调节适应性免疫反应中起着关键作用。NK细胞的细胞毒性功能是通过NK受体与靶细胞配体相互作用产生的抑制和刺激信号的相反作用来调节的。既往研究提示NK细胞参与PSC的发病机制。特异性HLA I类变异体，即NK细胞上杀伤免疫球蛋白受体（KIRs）的抑制性配体，在PSC患者中出现频率降低。相反，可直接激活NK细胞受体的激活配体（包括MHC I类链相关基因A (MIC-A)）显著增加。这些数据表明，KIR和/或HLA I类配体的失衡导致抑制减弱或激活增强可能是PSC发病的关键。值得注意的是，PSC肝源性NK细胞的细胞溶解活性受到损害，这是由于局部大量产生TNF-α。研究还表明，PSC患者结肠粘膜中的NK细胞增加。然而，KIR/HLA I类配体基因型如何影响NK细胞表型、易感性和功能，从而促进PSC发展的确切机制尚不清楚。

根据两种表面标记CD16和CD56的表达，可以将人类循环NK细胞分为不同的群体。两个主要亚群是CD56^bright CD16^dim/−（定义为CD56^bright）和CD56^dimCD16^bright/+（定义为CD56^dim）NK细胞。与CD56^bright NK细胞相比，CD56^dim NK细胞具有细胞因子分泌的潜力，而CD56^dim NK细胞具有与成熟分化状态相关的细胞毒性增强。在这项研究中，我们比较了一组PSC患者和HCs中NK细胞的表型和功能特征。我们的研究结果为理解NK细胞在PSC发病机制中的作用提供了新的信息，这可能有助于合理制定针对PSC中NK细胞的免疫治疗策略。

在这项研究中，我们检测了PSC患者外周血中NK细胞的表型特征和功能活性，并证明与HCs相比，PSC患者外周血中淋巴细胞中CD56^dim而非CD56^bright NK细胞的频率显著降低。我们进一步证明，PSC CD56^dim NK细胞分化程度较低，因为这些NK细胞CD57表达减少，而NKp46表达高。CD57被认为是NK细胞高度成熟和终末分化的标志。外周血中相对分化的CD57⁺ CD56^dim NK细胞的减少与PSC疾病严重程度相关的几种生物化学标志物水平显著相关。最后，我们发现来自PSC的CD56^dim NK细胞比来自HCs的细胞具有更大的细胞毒活性，特别是在通过NKp46介导的重定向杀伤作用中。重要的是，我们注意到CD57⁻CD56^dim NK细胞在PSC患者中表达高水平的NKp46，具有比CD57⁺ CD56^dim NK细胞更大的潜在细胞毒性能力。

对自身免疫中NK细胞的分析表明，在几种自身免疫性疾病（AIDs）中，循环CD57⁺ NK细胞的频率或绝对数量减少，这表明CD57⁺ NK细胞在预防和抑制AID中发挥调节作用。在这项研究中，我们证明CD57⁺ CD56^dim NK细胞在PSC中较少出现。

令人惊讶的是，我们发现在PSC患者中，NKp46^high CD57^- CD56^dim NK细胞比NKp46^low/- CD57⁺ CD56^dim NK细胞具有更强的细胞毒性，而在HCs中，即使NK细胞受到IL-2刺激，也没有检测到这种差异。我们提出CD56^dim NK细胞中CD57⁺与CD57^-的不平衡导致PSC患者的NK细胞群比来自HCs的NK细胞群具有更强的细胞毒性。在靶组织中，NK细胞倾向于CD57 ^-，具有较高的杀伤和脱颗粒能力，从而导致组织损坏。CD57在肝内NK细胞中的表达水平低于外周NK细胞。研究表明，CD56^dim肝NK细胞不是原始的组织驻留细胞，而是保留了外周CD56^dim NK细胞的归巢特征和表型，这表明这些细胞可以从外周迁移到肝脏。因此，NK细胞中CD57表达的失调和细胞毒性CD57⁻CD56^dim NK细胞在肝损伤部位的积累可能导致PSC胆道细胞损伤。

我们在此还证明，与HCs相比，PSC患者的CD56^dim NK细胞中NKp46的表达显著增加，而其他NK受体的表达不显著增加。进一步分析表明，NK细胞中NKp46的表达从CD56^bright到CD57⁻CD56^dim再到CD57⁺ CD56^dim逐渐降低。由于NKp46在CD57⁺或CD57⁻ NK细胞亚群上的表达在PSC和HCs之间没有显著差异，因此NKp46在PSC CD56^dim NK细胞中的表达高于HCs可能是由于NKp46^low/- CD57⁺ NK细胞的频率降低。事实上，在PSC CD56^dim NK细胞中，NKp46的表达与CD57的表达呈负相关。应该注意的是，活化受体NKp46对于NK细胞的体外功能至关重要，NKp46的表达密度与NK细胞的细胞溶解活性相关。在这里，我们证明了与HCs相比，P815靶细胞与NKp46结合导致PSC NK细胞的脱颗粒水平更高，这表明NKp46对NK细胞对抗靶细胞的体内活性至关重要。最近的研究也表明，NKp46^high NK细胞（包括CD57⁻CD56^bright细胞和CD57⁻CD56^dim细胞）比NKp46^dim NK细胞（主要是CD57⁺细胞）具有更高的细胞溶解活性和IFN-γ分泌。重要的是，这种NKp46^high NK亚群的数量与丙型肝炎病毒（HCV）患者肝脏炎症和损伤的严重程度密切相关。此外，表达NKp46的NK细胞也与IBD有关。IBD患者固有层淋巴细胞中产生IFN-γ的NKp46⁺ CD56⁺ NK细胞显著增加。在结肠炎小鼠模型中，IL-15依赖性NKp46⁺细胞通过募集炎性单核细胞放大肠道炎症。在目前的研究中，我们证明了与HCs相比，NKp46在PSC患者的循环CD56^dim NK细胞中表达显著增加，而CD56^bright NK细胞中表达不明显。基于NKp46和CD57的表达，我们进一步分析了CD56^dim NK细胞，发现NKp46^highCD57⁻NK细胞比NKp46^lowCD57⁺ CD56^dim NK细胞具有更强的裂解活性。NKp46参与增强了PSC中高表达NKp46的CD57⁻NK细胞的脱粒。有趣的是，最近一项对PSC肝内非实质细胞的研究表明，NKp46⁺细胞的频率较高与晚期纤维化有关。因此，尽管循环CD56^dim的NK细胞减少，但相对较高频率的NKp46^highCD57⁻细胞可能仍有助于PSC的发病机制。PSC患者肝脏中NKp46^highCD57⁻CD56^dim NK细胞的积累及其与激活配体的结合可能使它们对胆道上皮细胞具有更大的细胞毒性。

NK细胞表达自身MHC特异性抑制受体（如KIR、LIR-1或NKG2A）与更高的杀伤靶细胞能力相关，并通过激活受体产生IFN-γ以响应刺激。在这里，我们证明了CD158分子（包括KIR2DL1/S1/ S3/S5）在PSC NK细胞中的表达与HCs相比降低，而抑制受体NKG2A和CD94的表达没有显著差异。此外，CD158在PSC和HCs中CD57⁺和CD57⁻CD56^dim NK细胞之间的表达相似。我们注意到，与HCs相比，PSC患者中分别作为抑制性KIRs 3DL1和2DL1配体的HLA-Bw4和HLA-C2的频率显著降低。

如上所述，CD56^dim NK细胞从外周迁移到肝脏，而不是原来的肝脏组织驻留细胞。同时，从PSC患者身上获取组织样本非常困难。由此看来，我们认为外周血中CD56^dim NK细胞的数量可以在一定程度上反映PSC患者肝脏中CD56^dim NK细胞的肝内情况。因此，我们利用PSC患者的循环NK细胞进行研究。由于我们研究的局限性和技术挑战，进一步研究CD57⁻与CD57⁺ CD56^dim NK细胞中抑制和激活KIRs的表达可能会揭示这些信号如何调节NK细胞分化。我们也承认，对PSC患者肝内和外周NK细胞的单细胞测序研究将为阐明NK细胞在PSC发展中的作用提供直接的证据支持。