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作者：田青鹭 赵迪芳 关淑元 周媛 周昕 郑黎薇
通信作者：郑黎薇
作者单位：四川大学华西口腔医院
引用本文：田青鹭,赵迪芳,关淑元,等. 孕期尼古丁暴露对子代小鼠牙釉质形成的影响[J]. 中华口腔医学杂志,2023,58(01)：40-49.
目的
研究孕期尼古丁暴露对子代小鼠牙釉质形成的影响及其可能的表观遗传学机制。
方法
通过随机数字表法将10只C57BL/6孕鼠分为对照组（皮下注射生理盐水）及孕期尼古丁暴露（prenatal nicotine exposure，PNE）组（皮下注射尼古丁溶液），每组5只，孕鼠生产后分别收集出生后0 d（postnatal day 0，P0；P14、P25含义依此类推）、P14、P25新生小鼠，根据母代分组分为子代对照组及子代PNE组，并记录P0、P25子代小鼠体质量。采用显微CT（micro-CT）扫描分析、扫描电镜和维氏显微硬度检测对子代小鼠牙槽骨和下颌切牙进行硬组织相关参数分析。提取P25子代小鼠下颌骨组织及第3代牙上皮干细胞（dental epithelial stem cell，DESC）中的总RNA，通过实时荧光定量PCR检测成骨向及成釉向分化相关基因、增殖相关标志物和干细胞标志物的表达水平。采用石蜡切片免疫组织化学染色观察增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，Pcna）、釉原蛋白（amelogenin，Amelx）、甲基转移酶ZESTE增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，Ezh2）、组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰（histone H3 trimethylated at lysine 27，H3K27me3）阳性染色分布及水平。使用细胞增殖（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒对外源性添加不同浓度（0.01、0.1、1 mmol/L）尼古丁以及Ezh2抑制剂GSK126的DESC进行细胞活力检测。
结果
PNE组孕鼠较对照组更容易出现不良妊娠结局，P0时子代PNE组小鼠体质量［（0.99±0.02）g］显著低于子代对照组［（1.20±0.04）g］（ P<0.001）；P25时，子代PNE组小鼠体质量［（9.65±1.32）g］显著低于子代对照组［（15.26±1.70）g］（ P<0.001），死产率［（46.40±9.30）%］显著高于对照组（0）（ P<0.001）。P14和P25时，子代PNE组小鼠下颌切牙釉质矿化沉积点与第一磨牙近中面的距离数值［分别为（-1 349±45）、（-506±380）μm］均较子代对照组［分别为（-1 192±147）、（504±198）μm］显著减小（ P<0.05， P<0.001），提示矿化沉积点延迟。子代PNE组小鼠切牙釉柱及釉柱间质较对照组排列松散无序，显微硬度［（245.7±18.4）MPa］较子代对照组［（371.9±28.7）MPa］显著降低（ P<0.001）。HE染色显示子代PNE组小鼠前成釉细胞（pre-ameloblast，Pre-Am）区域排列较对照组紊乱，矿化沉积点推迟，暂时性扩增细胞（transit-amplifying cell，TA）及Pre-Am区域延长。免疫组织化学染色显示，子代PNE组小鼠唇侧颈环（labial cervical loop，LaCL）整体Pcna表达较子代对照组显著增多（ P<0.05），H3K27me3较对照组显著富集（ P<0.01），对应区域可见Ezh2表达显著增加（ P<0.01），同时成釉细胞胞质中Amelx阳性信号减弱。体外实验添加1 mmol/L 尼古丁能显著上调子代PNE组DESC的Pcna基因表达水平（ P<0.01），同时显著下调DESC标志物B淋巴瘤Mo-MLV插入蛋白1、富亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域1和成釉细胞向分化的相关基因Amelx等的基因表达水平（ P<0.05， P<0.05， P<0.01）。此外，与0 h时相比，干预24 h后1 mmol/L尼古丁可显著增强DESC的增殖活性（ P<0.001），添加10 μmol/L Ezh2抑制剂GSK126可挽救1 mmol/L尼古丁对DESC带来的增殖促进作用。
结论
孕期尼古丁暴露可能导致成釉向谱系定向分化过程延迟，致子代小鼠DESC增殖及分化异常，并且影响H3K27me3表观遗传修饰水平，造成子代牙釉质发育障碍，提示孕期尼古丁暴露是牙发育的危险环境因素。
牙釉质发育缺陷（developmental defects of enamel，DDE）是一种常见的口腔疾病，多与成釉器发育异常导致硬组织基质形成和矿化受到干扰有关。与正常牙釉质相比，DDE的存在增加了罹患乳牙早期龋和牙齿磨损的风险 ［ 1 ］ ，临床上可表现出牙体组织缺损、牙齿疼痛、咀嚼效率下降等症状。自1996年起，根据各国及地区的统计报道，乳牙列DDE患病率为10.0%~49.0% ［ 2 ］ ，常可发生于低龄儿童。由于低龄儿童依从性较差，通常难以获得理想的治疗，低龄儿童DDE可进一步对乳牙列建、乳恒牙替换等造成损害，最终影响颌面部发育乃至全身健康。然而，DDE的病因目前尚不明确，临床上多以对症治疗与功能恢复为主。近年有研究指出，乳牙DDE的发生可能与母亲孕期营养不足、感染或有害物质（如烟草、酒精、药物等）暴露等环境因素密切相关 ［ 3 , 4 ］ 。
尼古丁是各类传统香烟制品以及电子烟液、气溶胶中的主要化学成分，是一种剧毒生物碱且具有高度成瘾性。值得注意的是，尼古丁及其初级代谢产物可替宁均能通过胎盘屏障，分布于胎盘、羊水及胎儿体内，干扰胎儿代谢及发育过程 ［ 5 ］ 。多项研究表明，孕妇吸烟或孕期尼古丁暴露（prenatal nicotine exposure，PNE）可导致胎盘、新生儿脐带血、儿童血液以及颊上皮组织中DNA甲基化状态改变 ［ 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ］ ，这些基因可能与儿童癌症、唇腭裂等多种疾病的发生有关 ［ 13 , 14 ］ 。目前已有少量研究发现PNE对子代牙胚、成釉器及其他牙体组织的形态和结构发育存在影响，可以阻碍成牙本质向分化 ［ 15 , 16 ］ ，但其对牙釉质形成的具体作用及机制仍未可知。
如何早期阻断DDE的发生发展，规避不良环境刺激因素对子代个体牙发育的影响，是生命早期1 000 d口腔健康管理的重要课题。因此，本研究拟通过构建孕期尼古丁暴露的动物模型，探究其对子代牙釉质发育的影响，以期为建设妇幼友好的社会环境提供数据支撑和健康引导。
本研究的时间为2020年10月至2022年4月。动物实验经过四川大学华西口腔医院伦理委员会批准（审批号：WCHSIRB-D-2021-598）。
1.主要材料：尼古丁（ApexBio，美国）；通用SP试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；兔抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，Pcna）多克隆抗体、兔抗组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰（histone H3 trimethylated at lysine 27，H3K27me3）多克隆抗体、兔抗甲基转移酶ZESTE增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，Ezh2）多克隆抗体（Cell Signaling Technology，美国）；兔抗釉原蛋白（amelogenin，Amelx）多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔抗体（Abcam，美国）；4%多聚甲醛、乙醇、二甲苯、伊红、苏木素（Biosharp，美国）；实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）引物（北京擎科生物科技有限公司）；重组小鼠成纤维细胞生长因子、重组小鼠表皮细胞生长因子（R&D，美国）；达尔伯克改良伊格尔培养基F12（Dulbecco′s modified Eagle medium/F12，DMEM/F12）、青霉素-链霉素双抗溶液、0.25%胰蛋白酶溶液（Hyclone，美国）；SYBR定量PCR检测试剂盒（Vazyme Biotech，美国）；细胞增殖（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒（Dojindo Molecular Technologies，日本）；Ezh2抑制剂GSK126（MedChem Express，美国）；蛋白酶抑制剂、增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显影液（Thermo Fisher Scientific，美国）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）等。
2.实验方法：
（1）PNE小鼠模型的构建及动物分组：实验选用15只8周龄C57BL/6小鼠（体质量16~18 g，雌性10只，雄性5只），均购自四川大学动物实验中心。将10只雌鼠按随机数字表法分为对照组及PNE组，均以雌∶雄=2∶1的比例合笼，合笼时间为17：00，次日早上7：00检查雌鼠阴栓，以观察到阴栓计为孕0.5 d（gestational day 0.5，GD0.5）。自GD0.5，每日于14：00称量孕鼠体质量，按照2 mg/kg剂量皮下注射，分别给予对照组和PNE组孕鼠生理盐水及尼古丁溶液直至孕鼠生产。待孕鼠生产后，根据母鼠分组将子代小鼠分别定义为子代对照组和子代PNE组，收集出生后0 d（postnatal day 0，P0；P14、P25含义依此类推）、P14、P25小鼠用于后续实验。
（2）显微CT（micro-CT）：使用随机数字表法于P14、P25在两组小鼠中分别抽取6只子代小鼠，处死后收取双侧下颌骨并于4%多聚甲醛中过夜固定；取固定后小鼠左侧下颌骨，采用微计算机断层扫描仪（Scanco Medical，瑞士）对小鼠下颌骨进行显微CT扫描，使用Scanco Medical Evalution软件（1.1.19.0，Scanco Medical，瑞士）对骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp）、牙釉质矿化沉积点、相对釉质密度等进行三维重建及分析。
（3）扫描电镜及显微硬度测试：取小鼠左侧下颌骨，超声清洗10 min后干燥；依次使用600、1 000、2 000及3 000目碳化硅砂纸，沿小鼠下颌骨矢状向、切牙牙体长轴打磨并抛光后再次超声清洗10 min；使用1%硝酸酸蚀切牙45 s，去离子水冲净后隔夜干燥并喷金。扫描电镜（Quanta 400 FEG，FEI，荷兰）下观察切牙近切端1/3处牙釉质微观结构并采集图像（20 kV，5 000及10 000倍放大），将样本置于维氏显微硬度仪（MMT-X，Matsuzawa，日本）测定切牙近切端1/3处牙釉质显微硬度，每个样本重复测量3次并记录。
（4）免疫组织化学染色：将P25的两组小鼠下颌骨样本充分脱钙后矢状位包埋于石蜡中，制备5 μm厚组织切片。石蜡切片于65 ℃烤片30 min，至石蜡融化后行切片脱蜡、梯度乙醇水化，根据通用SP试剂盒说明书染色、封片，镜下观察阳性细胞数量及分布。
（5）牙上皮干细胞（dental epithelial stem cell，DESC）的提取及培养：取未经药物处理的正常8周龄雄性小鼠双侧下颌骨（ 图1A ），去除下颌骨上附着软组织，置于预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）中，体视显微镜（Olympus，日本）下使用手术刀去除小鼠下颌骨唇侧及舌侧骨板，暴露唇侧颈环（labial cervical loop，LaCL）；去除LaCL周围间充质组织，取出末端膨大的LaCL（ 图1B ），置于胶原酶中，于37 ℃孵箱消化2 h，用DMEM/F12完全培养基终止消化并重悬为单细胞悬液，按3×10 5个/皿将细胞接种于直径35 mm培养皿。将培养皿置于37 ℃、5% CO 2的细胞培养箱中培养3 d，观察并更换细胞培养液，此后每2天更换1次培养基。光学显微镜下观察可见纯化后的DESC呈鹅卵石、铺路石样排列，为典型的上皮细胞形态，无梭形或星形成纤维细胞污染，生长状态良好（ 图1C ）。
图1 体视显微镜下分离提取并培养小鼠切牙颈环处上皮干细胞原代细胞照片（低倍放大）A：小鼠下颌骨示意图，黄色虚线示下颌切牙位置；B：图A白色虚线方框放大图，为下颌切牙唇侧颈环（LaCL）及前成釉细胞（Pre-Am）区取样示意图，白色虚线示LaCL，黄色虚线示Pre-Am区；C：光镜下示上皮干细胞生长形态呈鹅卵石、铺路石样排列
（6）RT-qPCR：提取P25时去除牙齿的大鼠下颌骨组织及第3代DEPC中的总RNA，反转录合成cDNA，通过RT‐qPCR检测相关基因表达水平，引物序列见表1 。
（7）CCK-8细胞活力测试：根据实验分组设计，向体外培养的DESC外源性添加不同浓度（0.01、0.1、1 mmol/L）的尼古丁溶液，在培养的0、24 h时根据说明书进行CCK-8细胞活力检测，CCK-8溶液孵育时间为2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值（ A值），实验均设置空白对照，根据以下公式计算相对细胞活力。相对细胞活力=（ A 尼古丁处理组- A 空白组）÷（ A 阴性对照组- A 空白组）， A 尼古丁处理组为含有细胞、CCK-8溶液及药物溶液孔的 A值， A 阴性对照组为含有细胞、CCK-8溶液孔的 A值， A 空白组为不含细胞、含有CCK-8溶液及培养基孔的 A值。
（8）蛋白质印迹法检测：提取总蛋白后，使用BCA蛋白检测试剂盒检测所提蛋白浓度，根据浓度计算上样量，将蛋白溶液按照4∶1的比例加入5倍蛋白上样缓冲液，沸水浴变性5 min。电泳过程中浓缩胶电压为60 V恒压30 min，分离胶电压120 V恒压40 min，终止电泳后进行湿法转膜，转膜条件为250 mA恒流，50 min。漂洗膜后，采用5%胎牛血清封闭1 h，4 ℃冰箱过夜孵育一抗，次日室温孵育二抗1 h，用ECL显影液行化学发光显影，采集图像。
3.统计学分析：采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，使用Shapiro-Wilk检验验证数据均符合正态分布，Bartlett检验验证数据方差齐，采用单因素方差分析进行多组间数据比较，采用两独立样本t检验进行两组间数据比较，使用GraphPad Prism 9.0对统计数据进行绘图。实验结果以“”的形式表示，以双侧 P<0.05为差异有统计学意义。
（1）不良妊娠结局：见 表2 。PNE组雌鼠生育的子代PNE组P0及P25小鼠体质量均较子代对照组显著降低（ P<0.001），且死产小鼠数量较多，而对照组无死产现象发生，子代PNE组死产率［（46.40±9.30）%］较子代对照组（0）显著升高（ P<0.001）。
图2 体视显微镜下观察出生后25 d两组子代小鼠下颌切牙照片 A：子代对照组，示小鼠正常牙釉质；B：子代孕期尼古丁暴露组，示小鼠牙釉质发生不透明改变
图3 两组子代小鼠下颌骨微结构及牙相关参数的显微CT分析
（3）子代小鼠牙釉质表面形貌及硬度分析：扫描电镜结果显示，P14时子代PNE组小鼠切牙釉柱结构紊乱，釉柱间质尚不清晰，牙釉质形成水平较子代对照组滞后；P25时PNE组小鼠切牙釉柱及釉柱间质模糊不清、排列松散无序，而子代对照组釉柱排列整齐，釉柱间质清晰有序（ 图4 ）。此外，子代PNE组小鼠显微硬度［（245.7±18.4）MPa］较子代对照组［（371.9±28.7）MPa］显著降低（ t=8.36， P<0.001）。
图4 子代对照组及子代PNE组小鼠不同放大倍数扫描电镜结果
（1）DESC细胞增殖活力分析：见图5 。不同浓度尼古丁处理DESC 24 h后，0.01、0.1 mmol/L尼古丁均未显著影响细胞活力，而 1 mmol/L尼古丁处理组在24 h时DESC相对细胞活力（2.101±0.144）较0 h时（0.883±0.269）显著升高（ t=11.31， P<0.001），提示细胞增殖活力升高。
图5 不同处理组处理不同时间对子代小鼠牙上皮干细胞相对细胞活力的影响
（2）DESC增殖、分化及干细胞标志物表达水平：见图6 。在P25小鼠下颌切牙LaCL组织中，子代PNE组小鼠Pcna的表达显著上调（ t=4.78， P=0.005），DESC标志物B淋巴瘤Mo-MLV插入蛋白1（B lymphoma Mo-MLV insertion region 1，Bmi1）（ t=2.22， P=0.045）、富亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域1（leucine rich repeats and immunoglobulin like domains 1，Lrgi1）（ t=2.16， P=0.049）基因表达均较子代对照组显著下调。与体外细胞实验结果一致，使用1 mmol/L浓度尼古丁处理DESC 24 h后，Pcna的表达显著上调（ t=13.36， P<0.001），干细胞标志物Bmi1（ t=4.74， P=0.009）、Lrig1（ t=4.96， P=0.008）的表达显著下调。子代PNE组小鼠Pre-Am区中与DESC成釉细胞向分化的相关基因Amelx（ t=9.31， P=0.003）、成釉蛋白（ t=8.89， P=0.003）、釉蛋白（ t=25.47， P<0.001）、基质金属蛋白酶20（ t=4.55， P=0.004）的表达均较子代对照组显著下调。
图6 两组子代小鼠不同基因mRNA表达水平的比较 A：唇侧颈环（LaCL）干细胞标志物相关基因；B：牙上皮干细胞（DESC）标志物相关基因；C：LaCL增殖相关基因；D：DESC增殖相关基因；E：LaCL成釉向分化相关基因
（3）子代小鼠LaCL组织形态和釉质沉积点分析：见图7，8 。HE染色低倍镜下观察发现，子代PNE组小鼠切牙LaCL结构整体形态未见明显变化，但高倍镜下可见子代PNE组Pre-Am排列较子代对照组紊乱，TA区及Pre-Am区延长，矿化沉积点延迟。成釉细胞标志物Amelx的免疫组织化学染色结果显示，子代PNE组小鼠Am胞质中Amelx表达较对照组弱，且TA区及Pre-Am区延长，Amelx染色示矿化沉积点靠后，与HE结果一致。增殖相关标志物Pcna的免疫组织化学染色结果显示，两组Pcna表达均较活跃，子代PNE组小鼠LaCL、Pre-Am及Am区域整体Pcna表达均较子代对照组增多。子代对照组中，Pcna活跃表达部分基本存在于LaCL处，而子代PNE组Pcna活跃表达部分自TA区持续向Am区延伸。
图7 两组子代小鼠LaCL的HE染色及釉原蛋白（Amelx）免疫组织化学染色结果比较
图8 两组子代小鼠LaCL的增殖细胞核抗原免疫组织化学染色结果比较
图9 两组子代小鼠表观遗传相关基因及酶的免疫组织化学染色结果比较
（2）细胞增殖能力分析：见图10 。在处理24 h后，相较于0 h，阴性对照组和GSK126处理组对相对细胞活力无显著影响，1 mmol/L尼古丁处理组可以显著提高细胞活力（ P<0.001），提示促进增殖；而在GSK126处理组和GSK126+1 mmol/L尼古丁共处理组中，添加GSK126可抑制外源性添加尼古丁造成的细胞活力增加，提示抑制细胞增殖。
图10 不同处理组处理不同时间对子代小鼠牙上皮干细胞相对细胞活力的影响
（3）Ezh2和DESC中增殖及分化相关标志物mRNA表达水平：在子代PNE小鼠LaCL的总RNA（ t=4.50， P=0.004）以及从1 mmol/L尼古丁处理24 h 后的DESC中提取的总RNA（ t=4.67， P=0.003）中，Ezh2表达水平均在尼古丁暴露后较对照组显著上调（ 图11A ，B），与免疫组化染色结果一致（ 图9 ）。此外，Pcna表达水平在GSK126组（ P=0.016）及GSK126 +尼古丁处理组（ P<0.001）均较尼古丁处理组显著下调。干细胞标志相关基因Bmi1表达在GSK126组（ P=0.001）及GSK126 +尼古丁处理组（ P<0.001）均较尼古丁处理组显著上调。细胞标志相关基因Lrig1表达水平在GSK126组中较尼古丁处理组显著上调（ P=0.002），在GSK126 +尼古丁处理组与尼古丁处理组相比差异无统计学意义（ P=0.204， 图11C ）。
图11 两组子代小鼠甲基转移酶ZESTE增强子同源物2（Ezh2）和GSK126处理牙上皮干细胞（DESC）后相关基因表达的比较（GSK126为组蛋白酶甲基转移酶Ezh2抑制剂； a表示 P<0.01； b表示 P<0.05） A：Ezh2在出生后25 d两组小鼠切牙唇侧颈环（LaCL）组织中的表达（PNE为孕期尼古丁暴露）；B：Ezh2在两组体外培养的DESC中的表达；C：各组DESC标志物相关基因的表达（Pcna为增殖细胞核抗原；Bmi1为B淋巴瘤Mo-MLV插入蛋白1；Lrig1为富亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域1）
图12 两组牙上皮干细胞中组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K27me3）的蛋白质印迹法检测结果
（4）组蛋白甲基化蛋白水平：蛋白质印迹法结果显示，PNE可明显上调DESC中H3K27me3修饰水平，提示尼古丁可能通过表观遗传机制促进DESC中Ezh2介导的H3K27me3富集（ 图12 ）。
据报道目前我国15岁以上吸烟者近3亿人，其中女性吸烟者约1 200万名，数量居全球女性吸烟者第2位 ［ 17 ］ ，近40%的女性存在于家中或工作场所暴露二手烟的现象 ［ 18 ］ ，其中也包括需要无烟环境的孕期女性。根据世界卫生组织记录及多项国内外研究，孕期使用烟草或暴露于二手烟可导致早产、胎儿生长受限等诸多不良妊娠结局 ［ 19 , 20 , 21 , 22 , 23 ］ ，而尼古丁为烟草中公认的主要毒害物质。在本实验构建的PNE小鼠模型中，其后代同样表现出围产期死亡、出生时体质量减轻等，与既往动物学研究结果一致，证明本实验模型构建有效。本研究通过选取大约相当于人类1.5和3.0岁的P14及P25仔鼠进行实验，分别可对应人类牙齿萌出的乳牙萌出期及乳牙列期。本研究结果发现，P14和P25小鼠下颌切牙表现出牙釉质矿化沉积点延迟、釉柱及釉柱间质无序、显微硬度降低等表现，初步证明胚胎期尼古丁暴露对牙釉质形成存在不良影响。
干细胞的增殖和分化一直是各个领域干细胞研究的关键点，干细胞稳态的维持对于组织的更新、修复有至关重要的作用。小鼠切牙具有终生生长的特点，该生长由干细胞推动，是研究成体干细胞驱动的组织稳态的良好模型。在牙釉质发育过程中，DESC的自我增殖、干性维持过程以及成釉细胞向分化过程的动态平衡，是保证小鼠切牙牙釉质持续、正常、良好生长发育的先决条件。HE染色发现，子代PNE组小鼠LaCL中，自颈环分化至高柱状Am的过渡区域长度明显增加，且牙釉质矿化沉积点延迟，提示该组小鼠DESC进入成釉细胞分化过程可能推迟，与既往研究结果一致 ［ 24 ］ 。同时，子代PNE组小鼠中增殖状态标志物Pcna在免疫组织化学染色和RT-qPCR结果中均呈上调趋势，提示DESC的增殖状态活跃。进一步检测DESC成釉向分化标志物及相关干性维持及谱系分化基因表达水平后发现，子代PNE组中釉质分泌相关基因如Amelx、成釉蛋白、釉蛋白、基质金属蛋白酶20的表达均较子代对照组显著下调，提示成釉细胞的早期分化及釉质基质分泌过程受到显著抑制，因而导致后期牙釉质沉积异常、矿化过程延迟。
在多种表观修饰中，组蛋白甲基转移酶Ezh2特异性介导H3K27me3修饰状态的转录抑制作用已被明确可参与干细胞谱系调控 ［ 25 , 26 ］ 。Ezh2属于多梳家族成员，通过催化H3K27me3行使基因沉默功能。GSK126是一种有效的、高选择性的Ezh2甲基转移酶活性小分子抑制剂，其对Ezh2的选择性较其他甲基转移酶高1 000倍。本研究结果发现，PNE可致H3K27me3及相关酶Ezh2在子代小鼠LaCL区域富集，体外细胞学实验与上述实验结果一致，提示PNE也可能通过Ezh2介导H3K27me3表观遗传转录抑制作用干扰子代小鼠DESC的干细胞稳态，并参与DESC增殖及谱系调控过程。需要指出的是，本研究于小鼠终生生长的切牙模型中进行，后续研究可能需要进一步选择与人类牙齿更相似的磨牙进行验证。此外，由于PNE后子代小鼠死产率上升，子代繁育为一难点，本研究样本量较少，后续实验需要扩大样本量进行更深层的表观遗传机制探索。
综上，本研究为尼古丁对牙釉质形成的不利影响提供了实验证据，即PNE可致孕鼠不良妊娠结局增多，导致子代小鼠牙釉质结构不良及矿化延迟，并且提高子代小鼠DESC的增殖活性，推迟其成釉向分化进程。同时，本研究也说明减少PNE在优化生育层面的重要性，符合全生命周期健康管理的理念，对妇幼友好型社会环境的构建具有健康导向作用。
（参考文献略）
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