优化中心碳代谢(CCM)是一种有吸引力且具有挑战性的策略，可以改善酵母中有价值化学品的生物合成，因为CCM的调控非常复杂。Warburg效应，被称为有氧糖酵解，是癌细胞中一种显著的细胞代谢形式，其特点是通过增强的糖酵解途径摄取高水平的葡萄糖，即使在氧气存在的情况下，葡萄糖转化为乳糖的速度也会增加。除了调节Warburg效应对中心碳代谢(CCM)的影响外，该效应还阻止丙酮酸进入线粒体进行氧化磷酸化，并促进丙酮酸在细胞质中降解为乳酸。HIF-1复合体是一种由HIF-1α和ARNT（HIF-1β）组成的转录因子，可在多种类型的癌细胞中介导和诱导Warburg效应。先前的报道表明，HIF-1复合物可以在酵母细胞中表达，并在这种异源宿主中发挥类似的转录活性。
因此，作者认为HIF-1可以增加酵母细胞质中丙酮酸的积累，而酵母细胞中没有乳酸脱氢酶，因此细胞质中富集的丙酮酸有利于丙酮酸脱氢酶旁路，从而增加乙酰辅酶a的生物合成，最终提高下游角鲨烯的产量。
为了在酵母中触发与癌细胞有氧糖酵解类似的Warburg效应，作者将含有HIF-1α和ARNT基因的表达盒整合到菌株BY4741的酵母染色体中，编码HIF-1复合物的两个亚基，衍生出菌株XN01。通过与角鲨烯标品的GC谱图和MS数据对比发现（图2A和B），菌株XN01的角鲨烯产量为2.33 mg/L，比BY4741 （0.85 mg/L）提高了2.7倍（图2C）。结果表明HIF-1复合物的表达促进了酵母中角鲨烯的生物合成。
图1 HIF-1复合物介导的CCM重定向用于三萜生物合成的总体策略
图2 HIF-1促进了酵母中角鲨烯的生物合成
随后，为了检测HIF-1复合物的异位表达是否也会导致酵母中类似的代谢重编程，作者对菌株XN01和BY4741的富集RNA样本进行了三个生物重复的RNA测序。结果发现，在菌株XN01和BY4741中分别有50个和92个基因特异性表达（图3A）。如图3B所示，菌株XN01有263个差异表达基因。作者还进行了DEGs富集分析以及KEGG途径富集分析。结果表明(图3C、D)：大多数deg在核糖体、碳代谢、氨基酸生物合成和糖酵解/糖异生中显著富集。这种富集与在癌细胞中观察到的类似，核糖体和糖酵解/糖异生途径是KEGG富集最重要的途径。接下来，为了探究HIF-1复合物对菌株XN01的CCM，特别是糖酵解和TCA循环的影响，作者重点研究了这些代谢途径中编码酶的基因。转录组数据显示，几乎所有参与糖酵解的基因都上调，特别是HXK1、TDH1、TDH2、ENO1和CDC19的表达水平显著升高(图3E)。相反，大多数编码TCA循环酶的基因下调，如CIT3和IDP2(图3E)。
图3 BY4741和菌株XN01的转录组分析
优化MVA和类固醇合成的两种途径是在工程酵母菌株中增加三萜产量的常用策略。同时，UPC2是调控酵母麦角固醇生物合成途径中的多个ERG基因的转录因子。因此，为了进一步增加角鲨烯的产量，作者将含有tHMGR和UPC2 (UPC2-1)变体的单个拷贝整合到BY4741的染色体中，产生菌株XN02。结果表明：菌株XN02的角鲨烯产量为1.51 mg/L，是BY4741的1.8倍(图2C和图4)。
值得注意的是，使用HIF-1复合物的XN01中角鲨烯的产量远高于MVA途径优化后的菌株XN02，大约增加了1.5倍(图2C和图4)。接下来，为了大大增强角鲨烯的生物合成，我们将上述的多个拷贝分别整合到BY4741和XN01基因组的TY4位点，随后两株菌株的ERG9也通过用半乳糖诱导的启动子GAL10p取代其天然启动子而过表达。得到菌株XN03和XN04。与菌株XN03相比，引入HIF-1复合物后，XN04的角鲨烯产量提高到38.90 mg/L，提高了1.7倍。（图4）
图4 不同菌株角鲨烯产量
为了评价HIF-1复合物对三萜生物合成的促进作用，作者检测了XN01的麦角固醇含量(图5A-B)，结果显示，该菌株的麦角固醇产量为0.18 mg/L，是BY4741的2.5倍。为了进一步促进麦角固醇合成的代谢通量，作者在菌株XN03和XN04中用半乳糖诱导的启动子GAL10p取代环氧角鲨烯基因ERG1的天然启动子，过表达该基因，得到菌株XN05和XN06（图5C）。定量分析显示，菌株XN06的麦角甾醇产量为1145.95 mg/L，是菌株XN05的10.5倍（图5D）。
图5 HIF-1促进工程酵母菌麦角固醇的产生
为了明确HIF-1复合物是否能够促进外源三萜的生物合成，作者将含有GgLUS的表达载体转化到BY4741和菌株XN01-XN04中，得到菌株XN07-XN11。（图6A-B）。结果表明，携带HIF-1复合物的菌株对羽扇豆醇的生物合成有显著的促进作用。菌株XN08产生14.86 mg/L羽扇豆醇，比BY4741高2.8倍(图6C)。值得注意的是，该菌株的羽扇豆醇产量远高于菌株XN09 (8.65 mg/L)，染色体上有一个tHMGR和UPC2-1过表达盒（图6C）。在高度优化的菌株XN11中，HIF-1复合物将羽扇豆醇的产量提高到236.35 mg/L，与未经HIF-1转化的菌株XN10相比，增加了9.2倍（图6C）。这些结果共同表明，HIF-1复合物提高了角鲨烯衍生三萜的产量。
图6 HIF-1在工程酵母菌株中促进了羽扇豆醇的产生
原文链接：
https://doi.org/10.1007/s44307-023-00004-6
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摘译 | 左莎莎
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟
