MCF丨中国科学院天津工业生物技术研究所：大肠杆菌代谢工程用于从葡萄糖高水平生产乙酸苄酯

L-Phe是苄基乙酸酯生物合成途径中的重要中间体（图1）。为了获得高产L-Phe的底盘菌株，作者选择对实验室构建的U7菌株进行进一步改造。首先，将编码反馈抗性的预苯酸脱水酶的pheA^fbr受强组成型Pcore-trc启动子控制，整合到菌株U7的芳香族氨基酸输出基因yddG位点，恢复L-Phe的产量并减少L-Phe的输出，得到U7A菌株。然后将编码反馈抗性的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶（DHAP）的aroG^fbr受Pcore-trc启动子控制，整合到U7A的yghX位点，增强流向莽草酸途径的代谢通量，得到U7AG菌株。然后删除U7AG的tyrA以阻断酪氨酸生物合成途径，形成GAP菌株。将0.5 mLU7A、U7AG和GAP过夜种子培养物分别接种到250 mL摇瓶中的50 mLLB培养基中，菌株U7AG的L-Phe产量（0.95±0.04 g/L）是菌株U7A（0.45±0.01 g/L）的两倍。在Pcore-trc的控制下过表达aroG^fbr有效提高了L-Phe的产量。GAP菌株L-Phe产量最高，为1.02±0.03 g/L，因此以其作为底架菌株构建乙酸苄酯的生物合成途径。

图1 通过羧酸还原酶途径（途径I）和苯甲醛合酶途径（途径II）在工程大肠杆菌菌株中从头生物合成乙酸苄酯

接下来作者通过在大肠杆菌中利用羧酸还原酶延长苯甲酸生物合成的CoA依赖性β-氧化途径来进行苯甲醇生物合成。作者设计了一条通过BA从葡萄糖生物合成BALC的路线，如图1所示。该路线的关键步骤是在CAR催化下将BA还原为BALD。大肠杆菌中的天然ADH和AKR可以将醛分子自发转化为醇。CAR通常对许多羧酸底物具有混杂性。作为主要中间体的CA也可以在CAR的作用下转化为肉桂醇；因此，CA不能转化为CoA衍生物。因此，需要获得对BA具有高底物特异性的CAR才能成功构建该途径。研究通过在大肠杆菌中进行异源表达和BA喂养实验，测试了8种CAR对BA的活性，即来自朱砂红密孔菌的PcCAR4、来自Serpula lacrymans的NPS11、来自鸟分枝杆菌的MavCAR、来自海分枝杆菌的MmCAR、来自结核分枝杆菌的MsCAR、来自Segniliparaceae rotundus的SeCAR、来自Segniliparus rugosus的SrCAR和来自诺卡氏菌的NiCAR，以验证假设。PcCAR4的底物特异性较低，BA是其首选底物。NPS11对BA的偏好性比对CA高10倍。这些CAR在E. coli BL21（DE3）中由T7启动子调控表达，在BA或CA的补料实验中均检测到相应的BALC或肉桂醇。PcCAR4可以还原BA，转化率约为24.3%±1.5%，且未检测到肉桂醇，表明PcCAR4具有明显的BA底物特异性。NPS11可以以3.6%的转化率利用BA作为底物，而不能将CA转化为相应的产物。PcCAR4和NPS11被选为构建BALC生物合成途径（路线I）的候选基因。MavCAR、MmCAR、MsCAR、SeCAR和NiCAR对CA和BA均表现出较高的催化活性，底物转化率约为80%，并且没有表现出明显的BA偏好。SrCAR显示，BALC产量表明BA转化率为95.0%±8.1%，肉桂醇产量表明CA转化率为54.9%±3.7%。据报道，从L-Phe开始进行BA生物合成，CoA依赖的β-氧化途径I变体（图1）。苯丙氨酸氨裂解酶(RgPAL)将L-Phe转化为CA，肉桂酸：CoA连接酶(ScCCL^A294G)催化CA转化为CA-CoA。烯酰辅酶A水合酶(PhdE)、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(PhdB)和3-氧代酰基辅酶A酮水解酶(PhdC)依次被招募来将CA-CoA转化为BA。RgPAL、ScCCL^A294G、PhdE、PhdB和PhdC被克隆到在T7启动子控制下表达的pRSFDuet-1中，得到pRSF-I（图2A）。构建了含有NPS11的pET-NPSsfp和含有PcCAR4的pET-Pcppa（图2A）。进一步将pET-NPSsfp或pETPcppa导入含有pRSF-I的L-Phe产生菌GAP，分别得到EcBC01和EcBC02菌株，在G培养基中培养。通过HPLC和LC-HRMS分析检测EcBC01和EcBC02产生的BALC（图2B）。EcBC01和EcBC02的细胞生长情况基本相当。EcBC02菌株产生302.9±28.3 mg/L BALC，是EcBC01菌株产生BALC（79.7±4.5 mg/L）的3.7倍。结果表明，PcCAR4比NPS11具有更高的BALC合成效率。此外，EcBC02菌株发酵液中积累了699.0±44.0 mg/LBA和132.9±8.4 mg/LCA（图2C），未检测到肉桂醇的峰。MavCAR、MmCAR、MsCAR、SeCAR、NiCAR和SrCAR对CA和BA均有较好的催化活性，不适合用于构建BALC的生物合成途径。但考虑到SrCAR对BA的催化作用优于CA，作者将SrCAR引入大肠杆菌的BALC合成途径。将携带SrCAR的pRSF-I和pET-SrCARsfp共转化入GAP菌株，得到EcBCSr菌株。EcBC-Sr菌株中几乎检测不到BALC，主要产物为469.9±6.4 mg/L肉桂醇。

图2 通过途径I或途径II从葡萄糖生物合成BALC

在大肠杆菌中合成BALC后，应鉴定出活性更高的乙酰辅酶A/BALC乙酰转移酶(AAT)。测试了来自不同来源的ATT候选物从BALC生产苄基乙酸酯的能力。研究了来自S. cerevisiaeS288C的ATF1（具有无选择性的各种醇）、CATec3-Y20F（一种工程化的氯霉素乙酰转移酶(CAT)）和来自Nicotiana tabacum的ANN09798是否可用于合成苄基乙酸酯。将编码ATF1、CATec3-Y20F和ANN09798的基因引入EcBC02菌株，分别产生菌株EcYZ01、EcYZ02和EcYZ03。这些菌株采用两相原位萃取策略进行发酵，以1:10（v/v）十二烷覆盖以避免酯在摇瓶中挥发。用HPLC分析水相和有机相中的代谢物。结果如图3所示。在十二烷相代谢物的HPLC色谱图中观察到对应于苄基乙酸酯（tR=17.2分钟）的峰，这三种重组菌株均产生了该峰（图3A）。通过GC-MS分析进一步证实了结果（图3B）。因此，在大肠杆菌重组菌株中，可以从葡萄糖生物合成苄基乙酸酯。产生的苄基乙酸酯大部分被萃取到十二烷有机相中，只有少量的苄基乙酸酯留在水相中（图3C），携带ATF1的EcYZ01菌株、携带CATec3-Y20F的EcYZ02菌株和携带ANN09798的EcYZ03菌株的总乙酸苄酯产量分别为1151.8±35.4、810.7±81.6和530.1±38.5 mg/L。因此，ATF1比CATec3-Y20F和ANN09798更适合合成乙酸苄酯（图3D）。具有1:10（v/v）十二烷覆盖的EcYZ01的乙酸苄酯总产量比没有十二烷覆盖的EcYZ01高4倍（图3D）。两相原位萃取发酵对提高乙酸苄酯产量非常有效。在三株菌株培养的十二烷相中均检测到了副产物肉桂酸乙酸酯，其中含有ATF1的EcYZ01的产量为0.35±0.02mg/L，远低于EcYZ02和EcYZ03。作者在三株菌株的发酵液中检测到了CA的积累（图3C），而没有观察到肉桂醇的峰值。这表明在含有苄酸乙酸酯从头生物合成途径的菌株中，PcCAR4能够利用CA合成肉桂醇。菌株EcYZ04（含有pRSF-I和pET-NPSsfp-ATF1的GAP）仅生产32.78±5.5 mg/L苄酸乙酸酯（图3D）。

图3 重组菌株生产的乙酸苄酯

接下来作者通过在大肠杆菌中异源表达植物辅酶A依赖的β-氧化途径苯甲醛生物合成和ATF1（途径II）来合成乙酸苄酯。通过在途径II中导入植物辅酶A依赖的β-氧化途径（图1）来解决途径I中CAR在合成前体BALC时的活性混杂问题。途径II有一个共同的中间体KPP-CoA。KAT通过β-氧化缩短KPP-CoA的丙基侧链，将KPP-CoA转化为BA-CoA。来自矮牵牛的PhBS和PhKAT1被导入来建立从KPP-CoA到BALD的途径。构建携带ScCCL^A294G、RgPAL、PhdB和PhKAT1的pRSF-II用于BA-CoA生物合成（图1）。将pRSF-II与携带PhBS的pET-BS同时导入GAP，得到菌株EcBC03。将该菌株进行发酵，分析BALC产量。重组菌株EcBC03产量为283.0±24.6 mg/LBALC（图2B），略低于携带途径I相关基因的EcBC02的产量（302.9±28.3 mg/L）。随后，将编码ATF1的基因整合到EcBC03菌株中，得到菌株EcYZ05。EcYZ05在十二烷覆盖率为1:10（v/v）培养体积的两相原位萃取发酵中生产了122.3±14.3 mg/L乙酸苄酯（图3D）。通过途径I产生的乙酸苄酯的量是通过途径II产生的9倍。NADPH 是两种途径还原步骤中的关键辅助因子。来自酿酒酵母的编码NADH激酶的Pos5p可以直接磷酸化NADH产生NADPH。Pos5p*（不含线粒体靶向序列的Pos5p）在大肠杆菌中的过表达有效提高了NADPH依赖性生物过程的生产力。为了增强NADPH再生，提高BA还原效率并进一步增强乙酸苄酯的生物合成，作者将T7启动子控制下的Pos5p*整合到GAP菌株的aslA位点中，从而产生了GAP01菌株。将pRSFI和pET-Pcppa-ATF1质粒共转化到GAP01中，产生了EcYZ06菌株。如图4A所示，EcYZ06的细胞生长与EcYZ01（含有pRSF-I和pET-Pcppa-ATF1的GAP）相似，EcYZ06中乙酸苄酯的总产量为1039.7±29.8 mg/L，略低于EcYZ01（1151.8±35.4 mg/L），采用十二烷覆盖率为1:10（v/v）培养体积的两相原位萃取发酵。因此，NADPH供应可能不是限制因素。CkPta是一种将乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A的磷酸转乙酰酶，已应用于微生物宿主，以乙酰辅酶A为前体高效合成多种产物。密码子优化的CkPta由Pcore-trc启动子控制，并整合到GAP菌株的大肠杆菌天然Pta位点中，生成GAP01菌株。将pRSF-I和pET-Pcppa-ATF1质粒共转化到GAP01中，生成EcYZ07菌株。通过两相原位萃取发酵评估EcYZ07菌株的乙酸苄酯产量，十二烷覆盖率为1:10(v/v)培养体积。EcYZ07中乙酸苄酯的总产量为1532.3±31.5 mg/L，与菌株EcYZ01（1151.8±35.4 mg/L）相比增加了30%。EcYZ07（OD600=15.2）的细胞生长是EcYZ01的1.15倍（图4A）。结果表明，在大肠杆菌原生Pta位点中过表达CkPta可有效提高工程菌株中的乙酸苄酯产量。推测CkPta的过表达提高了工程菌株中的乙酰辅酶A库。

最后，作者利用两相原位萃取发酵来减轻产品毒性并提高最终产品滴度，1:1（v/v）十二烷原位萃取发酵是提高乙酸苄酯合成的最佳溶剂。研究了菌株EcYZ07在1:1（v/v）十二烷覆盖发酵中的细胞生长时间曲线和主要代谢物的滴度。将过夜种子培养物接种到G培养基后，每12小时取样一次。如图5A所示，细胞生长进入稳定期，发酵48小时后OD₆₀₀维持在14–16。发酵48小时后，乙酸苄酯产量达到3.0±0.2 g/L并逐渐稳定。同时检测到了其他代谢物。如图5B，C所示，发酵48小时后，副产物乙酸肉桂酯的产量仅为2.89±0.29 mg/L，没有BA的积累，但积累了6.7±0.4 mg/L CA 。

图5 在摇瓶中对工程大肠杆菌EcYZ07菌株（含有pRSF-I和pET-Pcppa-ATF1的GAP02）进行两相原位提取发酵，十二烷覆盖率为1:1（v/v）