bioRxiv | 白芷呋喃香豆素生物合成和调控机制的多组学研究

学术 2024-09-11 14:21 北京

呋喃香豆素（FCs）是重要的天然产物，具有植物防御分子和药理活性物质的双重作用。白芷（Angelica dahurica）是一种著名的草药，具有丰富多样的FCs。然而，白芷FCs在不同发育阶段的积累模式、生物合成途径和调控机制仍不清楚，阻碍了利用合成生物学方法生产FCs。

中国农业科学院深圳农业基因组研究所王丽研究员联合中国农业科学院作物科学研究所路则府研究员团队在预印本平台bioRxiv上发表题为“Integrative multi-omics data elucidating the biosynthesis and regulatory mechanisms of furanocoumarins in Angelica dahurica”的研究论文。

研究构建了白芷染色质水平的参考基因组，利用转录组、代谢组和ATAC-seq的多组学研究手段挖掘出参与白芷FCs生物合成的基因并阐明了染色质可及性对这些基因的表观遗传调控作用。

利用Pacbio HiFi和Hi-C数据，研究首先组装了一个染色体级别的白芷基因组，大小为4.89Gb，假定染色体11条，锚定率97.27%，预测的蛋白质编码基因有61,419个。白芷大约在17.45MYA从野胡萝卜中分离，1,878和2,089个基因分别收缩和扩张。

PD、WGD和TD是基因扩张的主要来源。所有的复制基因都富集初级代谢生物合成，而DSD、TD和PD复制基因富集次级代谢通路。这可能是白芷广泛积累多种次生代谢物的原因。

图1. 白芷基因组和进化

随着白芷根的发育，根直径不断增加随后稳定，而不同的香豆素含量呈现不同的变化趋势。尽管FCs的总浓度随着根发育略有下降，S5（9月）的最大根径仍导致此时的根具有最高的生物量。解释了在秋季抽薹前收获白芷根这种常见生产方法的基本原理。

图2. 白芷根发育和FC含量变化

根据《中国药典》（2020），异欧前胡素和欧前胡素是白芷的质量控制标准。它们的生物合成前体，佛手酚和花椒毒酚，分别是补骨脂素在C-5位（由补骨脂素-5-羟基化催化，P5H）及C-8位（由补骨脂素-8-羟基化催化，P8H）羟基化的产物。然而，白芷中负责P5H和P8H的基因未知。

已知植物中细胞色素P450s（CYP450s）家族负责呋喃环的形成和羟基化。研究从白芷中鉴定了310个CYP450基因，基于系统发育树、表达水平与代谢物含量的相关性，筛选了2个P8H基因和5个P5H基因进行进一步的实验验证。

AdP8H1、AdP8H2和AdP5H1在烟草瞬时表达系统中表现出相应的催化活性，分别命名为CYP71AZ19、CYP83F95、CYP71AZ18。有趣的是，CYP71AZ19和CYP71AZ18还是一对近端复制（PD）产物。

图3. 筛选控制P5H和P8H的候选基因

为了弄清楚白芷FCs生物合成的调控机理，研究对白芷叶片和发育阶段的根进行了ATAC-seq。染色质可及性在叶片和发育根中呈现相似的分布模式，富集在TSS和TES。叶片中的ACRs仅为3,833个，而根中的ACRs达29,410-56,543个。这些ACRs主要分布在远端间区和<1kb启动子中。

叶片的远端间区占比小于根，而根随着发育远端间区占比增加，说明远端调控事件对FCs的生物合成意义重大。正如在大多数植物中发现的一样，叶和根中具有ACRs的基因表达高于那些没有ACRs的，而同时具有远端和近端ACRs的基因表达高于那些仅具有远端或近端ACRs的，再次突出了远端ACRs对基因表达的重要性。

根和叶中，分别有6,494和2,381个上调DARs以及5,620和6,331个上调DEGs。值得注意的是，1,760个根高表达基因与根特异性ACRs重叠，富集苯丙烷类生物合成、与香豆素相关的生物合成等次生代谢通路。相反，仅295个叶高表达基因与叶特异性ACRs重叠，显著富集光合作用。这说明ACRs对调节根中参与苯丙素类生物合成途径基因表达的重要。

图4. 白芷染色质可及性景观及对基因表达的影响

3个已验证的FC生物合成基因中，CYP71AZ19和CYP71AZ18在根中表现出更高的表达水平和染色质可及性水平，再次表明染色质可及性对FC合成基因的调节作用。此外，在根中具有更高可及性的基因富集了与胁迫相关的TF结合基序，比如ABI3和WRKY，与FCs的生物防御功能一致。

放大到更广泛的FC生物合成途径上，具有与实验验证的催化功能的基因同源性超过75%的基因，它们在通路中的每一步，表现出染色质可及性水平、表达水平和下游产物浓度的一致性。这些基因可以作为后续实验验证和下一步研究的主要靶点。

图5. 染色质可及性调控参与FC生物合成途径的基因

综上，此研究为白芷提供了宝贵的基因组资源，丰富了其根发育过程中的次生代谢谱，填补了FC生物合成途径的空白，探索了FC生物合成基因的进化，剖析了基因表达和代谢产物生物合成的表观遗传调控。

研究结果增进了我们对FC生物合成途径和CYP450谱系特异性复制在FC多样化中的作用的了解，并有助于理解表观遗传调控对基因表达的影响，这为通过生物合成技术代谢产生FC提供了见解。

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