年度优秀论文 | 龋病和牙周病患者唾液菌群和代谢产物的比较研究

健康 2024-09-14 16:30 北京

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作者：吴昊泽张晓程小刚余擎

通信作者：余擎

作者单位：第四军医大学口腔医学院牙体牙髓病科　军事口腔医学国家重点实验室　国家口腔疾病临床医学研究中心　陕西省口腔医学重点实验室

引用本文：吴昊泽, 张晓, 程小刚, 等. 龋病和牙周病患者唾液菌群和代谢产物的比较研究[J]. 中华口腔医学杂志, 2023, 58(2): 131-142. DOI: 10.3760/cma.j.cn112144-20220829-00464.

摘要

目的

明确龋病和牙周炎来源的唾液菌群在物种组成、功能及代谢产物上的特点，为寻找可用于临床判断龋病和牙周炎发生的生物标志物提供依据。

方法

收集2022年3至6月就诊于第四军医大学口腔医学院牙体牙髓病科的10例高龋［龋失补牙数（decayed-missing-filled teeth，DMFT）≥6］患者［高龋（high caries，HC）组］，牙周科的10例Ⅱ期A级~Ⅲ期C级牙周炎患者［牙周炎（periodontitis group，PG）组］和10名口腔健康个体［健康对照（healthy individuals，HH）组］的唾液样本。采集受试者的人口学基线、口腔内龋、牙周健康情况等信息，利用宏基因组测序和液相色谱质谱联用检测样本内微生物及其代谢产物。对测序数据进行分析获得各组样本的微生物物种分类学组成、功能基因及代谢产物的信息。各组受试人群的口腔基本情况及唾液样本采集均由同一名牙体牙髓病科主治医师完成。

结果

各组受试人群在年龄、性别等基线特征上差异均无统计学意义（P>0.05）。HC组DMFT（9.0±1.7）显著高于HH组和PG组（均为0）（F=243.00，P<0.001）。菌群分析显示，各组唾液菌群物种分类学组成在门水平均以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和梭杆菌门为主。在属水平，则主要由链球菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、普雷沃菌属等成员组成。差异分析显示，与HH组相比，HC组和PG组在属、种水平的物种分类学组成差异均有统计学意义（P<0.05）。在属水平，HC组和PG组相对丰度改变最显著的均为普雷沃菌属。而在种水平，HC组改变最显著的为苍白普雷沃菌；PG组改变最显著的为牙龈卟啉单胞菌。代谢产物分析显示，HC组共检出133种与HH组差异表达的代谢产物，其中差异最显著的代谢产物为3-羟基-1，5-二苯基戊烷-1-酮（P=0.001）。在PG组中，共检测出102种与HH组差异表达的代谢产物，其中差异最显著的代谢产物为N1-乙酰精胺（P=0.002）。HC组与PG组相比，代谢产物上差异最显著的代谢产物为D-氨基葡萄糖6-磷酸（P=0.006）。菌群代谢功能分析显示，HC组菌群糖代谢相关的功能基因丰度最高，其次为HH组，PG组的糖代谢相关功能基因最低。此外，与HH组相比，PG组内ABC转运体和磷酸转移酶系统等涉及糖转运相关的功能基因的丰度显著降低（P<0.05），在HC组中则显著升高（P<0.05）。

结论

唾液菌群在龋病、牙周炎及健康人群中存在显著异质性，且菌群的糖代谢能力改变与龋病和牙周炎的发生存在一定关联。苍白普雷沃菌及3-羟基-1，5-二苯基戊烷-1-酮可能作为龋病的潜在生物标志物；而牙龈卟啉单胞菌及N1-乙酰精胺可能作为牙周炎的潜在生物标志物。

龋病和牙周炎的病因学研究由来已久^［^1 ］。作为我国最常见的两类口腔疾病^［^2 ］，尽管致病机制尚未完全明确，但二者的发生均与微生物因素密切相关。诸如变异链球菌（Streptococcus mutans）、唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）、内氏放线菌（Actinomyces naeslundii）等产酸耐酸菌^［^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 ］}；牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、福赛斯坦纳菌（Tannerella forsythia）、齿垢密螺旋体（Treponema denticola）等细菌组成的红色复合体分别在龋病、牙周炎的发生、发展中扮演了重要角色^［^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 ］}。

近年随着高通量测序等技术的进步，不依赖培养的研究方式拓宽了人们对微生物在龋病、牙周炎发病中作用机制的认识^［^13 ］。包括但不限于细菌，其他如白色念珠菌（Candida albicans）、EB病毒等真菌和病毒在龋病和牙周炎中的致病机制同样不可忽视^［^{14 , 15 ］}。代谢组学等技术则进一步证实，宿主体内的微生物可参与并构成维持机体健康的重要组成部分^［^16 ］。例如，肠道菌群通过代谢日常饮食产生5-羟色胺等神经递质，继而影响远端中枢神经系统，这一机制被称为“脑肠轴”^［^17 ］。在口腔疾病中，关于代谢产物的研究同样由来已久。Miller在1980年就提出有机酸等代谢产物对龋病的影响；而肥胖、糖尿病等代谢紊乱疾病同样是导致牙周炎发生的危险因素^［^18 ］。目前关于口腔微生物群落通过代谢作用影响口腔疾病发生的研究尚不完善。对龋病、牙周炎微生物因素及其通过代谢作用的认知不足也导致目前治疗手段单调，无法做到对患病人群的靶向治疗和对高危人群的精准防控。因此，进一步明确这两种口腔常见病的发病机制，寻找可行的预测手段，筛查并关注高风险人群，从根源上降低疾病的发生风险是当前亟待解决的临床任务。唾液微生物在样本采集上具有便捷性与无创性；同时相较于口腔其他单一位点，在研究结果上也更具有整体代表性，因此近年来被用于多种疾病的预测、诊断和预后判断^［^{19 , 20 , 21 ］}。代谢组学技术为微生物和宿主相互作用的研究之间搭起了一座桥梁^［^22 ］。

本研究通过采用包含宏基因组学和代谢组学在内的多组学手段，通过研究受试者唾液微生物物种组成、功能表达和代谢模式改变，进一步探索龋病和牙周炎的发病机制，并判断微生物源性生物标志物是否可用于判断龋病、牙周炎等口腔疾病的发生，为后续微生物致病机制研究及疾病的临床精准防治提供依据和方向。

材料和方法

本研究为横断面研究，研究方案已经过空军军医大学第三附属医院伦理委员会审批（审批号：IRB-REV-2022131），受试者均签署知情同意书。

1.研究对象的选择：纳入2022年3至6月就诊于第四军医大学口腔医学院牙体牙髓病科的10例龋病患者、牙周科的10例牙周炎患者，另从本院牙体牙髓病科医护人员中选择10名符合标准的健康受试者作为对照。收集所有受试者的唾液样本及临床资料。其中龋病和牙周炎患者分别为观察组1［高龋（high caries，HC）组］和观察组2［牙周炎（periodontitis，PG）组］，健康受试者为健康对照（healthy individuals，HH）组。

（1）HC组纳入标准：①年龄35~44岁；②全口无明显牙周脓肿、癌前病变、真菌感染和智齿冠周炎等口腔疾病；③所有受试者余留牙数均≥28；④龋失补牙数（decayed-missing-filled teeth，DMFT）≥6。

（2）PG组纳入标准：①年龄35~44岁；②全口无明显口腔脓肿、癌前病变、真菌感染和智齿冠周炎等口腔疾病；③所有受试者的余留牙数均≥28；④根据2017年牙周炎分期分级新标准符合Ⅱ期A级至Ⅲ期C级的诊断标准^［^23 ］。

（3）HH组纳入标准：①年龄35~44岁；②全口无明显龋损、牙周炎、口腔脓肿、癌前病变、真菌感染和智齿冠周炎等口腔疾病。

（4）所有受试者排除标准：① 近6个月内全身使用抗生素或免疫抑制剂等；②患有需长期用药治疗的全身系统性疾病，如糖尿病、肿瘤、心脑血管疾病等；③存在吸烟史；④孕期及哺乳期妇女；⑤近6个月内有口腔药物及手术治疗史。

2.样本采集：所有受试者采样前1天晚饭后刷牙，然后禁饮食、禁止任何口腔清洁措施，直至第2天早上进行唾液样本采集。唾液样本：采集样本前嘱受试者切勿咳痰，采用非刺激性的方法获得唾液样本，嘱患者手持唾液收集容器；静坐，低头，口微张，睁开眼，头微前倾；避免吞咽，保持该姿势5 min，使唾液自然流入15 ml无菌离心管中，收集量至少达到2 ml（唾液中不含血、食物残渣、痰等杂质），否则应重复上述步骤。对所有采集到的样本进行分组编号后置于液氮中冷冻，并于2 h内送至实验室，置于-80 ℃冰箱内保存。

3.样本 DNA 提取：根据产品制造商说明，通过 NEBNext 微生物组DNA富集试剂盒（New England Biolabs，美国）提取唾液样本微生物群落 DNA。使用 Qubit dsDNA BR 分析试剂盒（Invitrogen，美国）和荧光光度计（Qubit Fluorometer，美国）对微生物群落DNA进行定量，并在1%琼脂糖凝胶上进行质量检查。

4.宏基因组文库的构建：取样本的1 μg基因组DNA，使用NEBNext^® Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美国）进行文库构建，用Covaris 超声波破碎仪随机打断成长度约为 350 bp 的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR 扩增等步骤完成整个文库制备。

5.上机测序及数据组装：文库构建完成后，先使用 Qubit^®2.0荧光定量仪（Thermo，美国）进行初步定量，稀释文库至2 ng/μl，随后使用 Agilent 2100生物分析系统（Agilent，美国）对文库的插入片段大小（insert size）进行检测，片段大小符合预期后，使用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度>3 nmol/L），以保证文库质量。库检合格后，将不同文库按有效浓度及目标下机数据量的需求进行资源集中（pooling）后进行Illumina PE150测序。使用Readfq 8.0（https：//github.com/cjfilelds/readfq）对 Illumina测序平台获得的原始数据（raw data）进行预处理，获取用于后续分析的有效数据（clean data）。使用 Megahit 1.0.4软件（https：//github.com/voutcn/megahit）对有效数据进行组装分析。

6.代谢物提取及检测：取100 μl样本置于EP管中，加入400 μl的80%甲醇水溶液；涡旋振荡，冰浴静置 5 min，15 000 ×g、4 ℃离心 20 min；取一定量的上清液加质谱级水稀释至甲醇含量为53%；15 000 ×g、4 ℃离心 20 min，收集上清液，进样行液相色谱质谱联用分析。

7.统计学分析：使用SPSS 22.0统计软件对结果数据进行统计学分析。采用K-S检验验证数据的正态性，采用Levene检验验证数据是否方差齐。计量资料，对于方差齐的正态分布数据以“”表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；方差不齐或偏态分布数据采用Kruskal-Wallis秩和检验或Mann-Whitney U 检验。对性别等计数资料采用行×列表χ²检验比较。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

8.生物信息学分析：利用R语言包在物种、功能基因和代谢水平上进行分析。选取互为对照的两组中最大相对丰度排名前10的物种，并将其余物种设置为其他，绘制各样品对应的物种注释结果在不同分类层级上的相对丰度柱形图。基于样本相似性距离矩阵进行PCoA分析及Anoism分析计算微生物物种组成上的差异，Anosim分析图中，R值介于-1和1之间，R>0，说明组间差异显著；R<0，说明组内差异大于组间差异，统计分析的可信度用P值表示，以P<0.05表示差异有统计学意义。使用LEfSe分析绘制LDA评分图并确定不同组间的差异物种。运用偏最小二乘回归，建立各比较组的偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）模型，经过7次循环交互验证，评价得到的模型是否可靠。参考变量投影重要性（variable importance projection，VIP）、差异倍数（fold change，FC）和P值3个参数，设定阈值为VIP>1.0，FC>1.200或FC<0.833且P<0.05，筛选差异代谢产物。以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，用 ROC 曲线下面积（area under the curve，AUC）评判潜在的生物标志物。当AUC=0.5时，该生物标志物对预测事件发生完全不起作用，无预测价值。当AUC>0.5 时，AUC 值越接近1，预测的准确性越高；通常AUC>0.5且≤0.7时预测准确性较低；AUC>0.7且≤0.9时有一定预测准确性；AUC>0.9时有较高的预测准确性。通过KEGG数据库注释，进一步明确该代谢产物可能代表的功能学意义。利用KEGG、CAZy数据库对功能基因进行聚类分析，寻找组间差异显著的功能基因模块。最后，使用MetaStats分析筛选和比较丰度差异存在统计学意义的功能基因，其中非参数分析采用Wilcoxon符号秩检验。

结果

1.受试人群临床相关基线特征分析：本研究共纳入30例受试者，其中HC组10例，年龄（39.1±2.3）岁，男性6例，女性4例；PG组10例，年龄（39.9±2.1）岁，男性5例，女性5例；HH组10名，年龄（38.1±2.0）岁，男性4名，女性6名。3组受试者的年龄、性别差异均无统计学意义（F=1.56，P=0.23；χ²=0.80，P=0.67）。HC组DMFT（9.0±1.7）显著高于其余两组（均为0）（F=243.00，P<0.001）。PG组牙周炎分期分级分别为ⅡA 1例、ⅡB 2例、ⅡC 3例，ⅢB和ⅢC各2例，主要集中于Ⅱ期A级至Ⅲ期C级；HC组和HH组均牙周正常。

2.不同组别物种分类学组成的差异分析：门、属水平的优势菌在各组中的相对丰度见图1 ，各组菌群在门水平均主要集中于变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和梭杆菌门（Fusobacteria）。在属水平，各组唾液微生物群落主要由链球菌属（Streptococcus）、奈瑟菌属（Neisseria）、罗氏属（Rothia）、普雷沃菌属（Prevotella）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、梭杆菌属（Fusobacterium）以及韦荣球菌属（Veillonella）等组成。但在不同的组别中，上述成员的相对丰度明显不同。在门水平，与HH组相比，HC组拟杆菌门、放线菌门和梭杆菌门的相对丰度升高，变形菌门和厚壁菌门的相对丰度降低；在PG组中则表现为拟杆菌门、梭杆菌门的相对丰度升高，放线菌门、变形菌门和厚壁菌门的相对丰度降低。在属水平，与HH组相比，HC组链球菌属、奈瑟菌属、嗜血杆菌属相对丰度降低，而罗氏菌属、普雷沃菌属、梭杆菌属及韦荣球菌属的相对丰度升高；在PG组中，则表现为链球菌属、奈瑟菌属、嗜血杆菌属、罗氏菌属的相对丰度下降，普雷沃菌属、梭杆菌属及韦荣球菌属的相对丰度升高。PCoA和Anosim分析显示，唾液菌群的分类学组成受到疾病影响而产生差异：在种水平，HC组与HH组（R=0.14，P=0.048）、PG组与HH组的物种分类学组成差异均有统计学意义（R=0.19，P=0.017），见图2 。如图3 进化树分支图显示，HC组中的放线菌纲（Actinobacteria）、丹毒丝菌纲/丹毒丝菌目（Erysipelotrichia/Erysipelotrichiales）、乳酸杆菌目（Lactobacillales）、拟杆菌目（Bacteroidales）为显著差异优势菌（P<0.05）。而PG组中，螺旋体纲/螺旋体目/密螺旋体科（Spirochaetia/Spirochaetales/Treponemataceae）、ε-变形菌纲（Epsilonproteobacteria）、拟杆菌目（Bacteroidales）、弯曲杆菌科（Campylobacteraceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）为显著差异优势菌（P<0.05）。LDA值分布柱状图分析显示，HC组和PG组在属水平FC最大的均为普雷沃菌属（Prevotella）。在种水平，HC组FC最大的为苍白普雷沃菌（Prevotella pallens），而PG组中FC最大的为牙龈卟啉单胞菌。

图1 高龋（HC）组、牙周炎（PG）组和健康对照（HH）组受试者唾液菌群优势菌在门和属水平的相对丰度比较及聚类热图 A：门水平HC组与HH组相比；B：门水平PG组与HH组相比；C：门水平聚类热图；D：属水平HC组与HH组相比；E：属水平PG组与HH组相比；F：属水平聚类热图

图2 高龋（HC）组、牙周炎（PG）组和健康对照（HH）组受试者的唾液样本在物种分类学上的组成差异分析 A：门水平的PCoA分析；B：门水平的Anosim分析，HC组与HH组的物种分类学组成差异有统计学意义（R=0.14，P=0.048）；C：属水平的PCoA分析；D：属水平的Anosim分析，PG组与HH组的物种分类学组成差异有统计学意义（R=0.19，P=0.017）

图3 高龋（HC）组、牙周炎（PG）组和健康对照（HH）组唾液样本在物种分类学上的差异微生物LEfSe分析和相应的进化树分支图 A、C：进化树分支图；B、D：LEfSe分析

3.HC组和PG组来源的菌群在代谢模式及产物上的差异分析：如图4 中PLS-DA模型显示，正、负离子模式下，各组拟合模型均显示R2Y>Q2Y，表示模型建立过程中未出现“过拟合”，模型建立结果可靠，HC组、PG组菌群与HH组表现为各不相同的代谢模式。以VIP、FC、P值3个参数共同作为筛选标准后，结果显示（图5 ），在HC组共检出133种与HH组差异表达的代谢产物，其中差异最显著的代谢产物为3-羟基-1，5-二苯基戊烷-1-酮（P=0.001）。在PG组中，共检测出102种与HH组差异表达的代谢产物，其中差异最为显著的代谢产物为N1-乙酰精胺（P=0.002）。ROC曲线结果显示，二者的AUC值分别为0.99和0.90，表明使用上述两种代谢产物作为预测指标时具有良好的准确性（图6 ）。而当比较HC组和PG组时，共检测出75种差异表达的代谢产物，其中差异最显著的代谢产物为D-氨基葡萄糖6-磷酸（P=0.006）。该产物在HC组中显著升高，而在PG组中降低。KEGG数据库注释结果显示，D-氨基葡萄糖6-磷酸主要表达在包括“氨基糖和核苷酸糖代谢”和“胰岛素抵抗”等糖代谢相关的通路中（图7 ）。

图4 不同离子模式下高龋（HC）组和牙周炎（PG）组菌群代谢偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型 A、B、C：正离子模式；D、E、F：负离子模式

图5 正、负离子模式下高龋（HC）组、牙周炎（PG）组和健康对照（HH）组的差异代谢物火山图 A、B、C：正离子模式；D、E、F：负离子模式

图6 高龋（HC）组、牙周炎（PG）组和健康对照（HH）组差异代谢产物的受试者工作特征曲线 A：3-羟基-1，5-二苯基戊烷-1-酮；B：N1-乙酰精胺

图7 高龋（HC）组和牙周炎（PG）组中D-氨基葡萄糖6-磷酸的相对丰度差异图及该产物在KEGG数据库中通路富集气泡图 A：相对丰度图；B：气泡图

4.HC组和PG组来源的唾液菌群在糖代谢相关功能改变的差异分析：首先，以健康对照组作为基线，KEGG数据库功能聚类分析显示，HC组菌群糖代谢相关的功能基因丰度最高，其次为HH组，PG组的糖代谢相关功能基因最低（图8A ）。碳水化合物酶专业级数据库CAZy分析结果显示，与HH组相比，PG组菌群的糖代谢相关功能基因丰度显著降低，而HC组则显著升高（图8B ，C）。此外，除了糖类代谢能力的差异，与HH组相比，PG组和HC组菌群在糖类物质向胞内转运的能力上同样存在差异。包含糖类相关ABC转运体和磷酸转移酶系统相关的功能基因cmtB、exoP在PG组唾液微生物中均无表达，在HH组中均为特异性表达，cmtB、exoP基因的相对丰度分别为［（4.24±1.86）×10^-6］%、［（2.98±1.95）×10^-6］%，与HH组相比差异均有统计学意义（t=55.00，P=0.001；t=45.00，P=0.001）；而功能基因malK、chvE在HC组唾液微生物中的相对丰度｛分别为［（4.82±4.54）×10^-7］%和［（4.37±9.87）×10^-6］%｝与HH组相比｛分别为0和［（6.53±5.07）×10^-7］%｝均显著升高（t=34.00，P=0.029；t=36.00，P=0.011）。

图8 高龋（HC）组、牙周炎（PG）组和健康对照（HH）组菌群KEGG level 2 层级和CAZy EC层级碳水化合物酶相对丰度聚类热图 A：KEGG level 2层级；B：HC组与HH组CAZy EC层级碳水化合物酶；C：PG组与HH组CAZy EC层级碳水化合物酶

讨论

本研究通过对牙周炎、龋病、健康人群3种不同来源的唾液菌群分析，证实了口腔生态环境失衡与唾液微生物群落的物种组成、功能表达和代谢模式的改变之间存在一定关联。其中，微生物群落的代谢，尤其是糖代谢功能的改变在不同疾病状态下存在显著差异。因此，唾液微生物群落糖代谢功能的具体变化及其相应的代谢产物改变，可能作为临床预测龋病和牙周炎发生风险的潜在检测指标及生物标志物。

龋病和牙周炎的发生发展均与口腔微生态的改变息息相关。这种改变首先体现在物种组成上。尽管龋病和牙周炎是两种在发病机制、病理表现等方面截然不同的疾病，但在物种属水平的改变上，却都以普雷沃菌属最为显著。普雷沃菌隶属于口腔五大菌门中的拟杆菌门，是该门中占比最高的成员。但遗憾的是，普雷沃菌属作为口腔核心微生物组的重要组成部分^［^24 ］，目前对其了解还甚少。近年肠道微生物相关研究指出，普雷沃菌属是一类成员及其复杂，在种水平上差异较大的微生物集合^［^25 ］。该菌属最显著的特征在于其基因组中具备复杂糖类，如淀粉等植物性多糖的代谢酶活性，且这种活性在人群间和人群内部高度可变^［^26 ］。这提示，本研究中聚焦的普雷沃菌属及其相应的糖代谢功能改变是进一步探索龋病和牙周炎致病机制的关键。

作为长期寄居在人体内的共生体（symbiosome），微生物群落可以通过遗传漂变的作用，逐渐摒弃一部分冗杂的功能基因，而仅保留其重要的核心功能，以实现群落整体效率的最优化^［^27 ］。糖代谢能力正是微生物群落在与宿主相互适应，共同进化过程中所保留的核心功能之一，其重要性可体现在如下两个方面：①碳源是一切生命体最重要的能量来源，代谢碳水化合物可为微生物群落提供维持基本生命活动的能量。②对宿主而言，微生物群落对多种糖类的代谢能力拓宽了人体对糖类的利用能力。例如，纤维素等膳食纤维，由于不能被人体消化，而在早期被认为是无用之物。但近年研究指出，膳食纤维等复杂碳水化合物可以被Prevotella copri等细菌代谢为短链脂肪酸等终末产物，在维持肠道正常生理功能与导致炎性肠病等疾病中担任重要角色^［^28 ］。碳水化合物或糖类，在龋病中的地位已得到广泛关注。

频繁或大量摄入糖类物质可导致龋病的发生^［^{29 , 30 ］}。糖类物质在变异链球菌等产酸耐酸菌的作用下，无氧酵解生成乳酸。有机酸进一步增强了产酸耐酸菌的生态优势位，最终导致原有的微生态失衡^［^31 ］。生态失衡学说合理解释了过量或过频的糖类物质作为一种外界扰动（perturbation）是如何导致生态失衡的，但尚不能解决一个关键问题：对个体而言，如何界定糖类是否摄入过量或过频？注意控制糖类摄入但仍罹患龋齿的患者临床上并不少见。结合上述分析可以认为，这一问题的答案取决于个体口腔微生物群落物种组成及功能。不同个体口腔微生物群落糖代谢功能存在差异，这种差异可能是由于组成群落的普雷沃菌属在种水平的差异所致。西方人群高脂高蛋白的饮食结构中，蔗糖占每日摄入碳水化合物的比重较大；我国民众以米面作为主食，淀粉等复杂多糖占比最高。近年关于肠道微生物的研究指出，饮食习惯是导致肠道微生物群体间异质性的重要原因^［^32 ］。植物性复杂多糖的摄入增多可显著改变肠道中普雷沃菌的多样性和丰度，而这种现象同样发生在口腔菌群中^［^25 ］。在本研究中也初步发现，HC组患者唾液中普雷沃菌属的相对丰度显著升高。因此，当某一群体口腔微生物群落中普雷沃菌携带大量糖代谢功能基因时，其可能通过将淀粉等其他微生物不宜利用的复杂多糖分解为二糖或单糖供变异链球菌等产酸耐酸菌利用，从而加重龋病的发生风险。近年有研究指出，淀粉可加剧蔗糖的致龋作用^［^33 ］，佐证了本研究的观点。在后续研究中，课题组将在种水平和株水平继续研究普雷沃菌属的糖类利用能力，以进一步完善该理论。

相较于龋病，碳水化合物及其代谢对牙周炎的影响则一直被低估。众所周知，罹患糖尿病可增加牙周炎的发生风险^［^34 ］。由于内皮细胞对葡萄糖的转运能力差，高血糖可导致大量葡萄糖堆积在细胞内^［^{35 , 36 ］}。这种不正常的毒性累积可引发一系列后续反应。如促进氧化应激、糖化末端产物（advanced glycosylation end-product，AGE）可损害内皮细胞的功能和诱导炎症发生等^［^{37 , 38 , 39 ］}。因此，大量不能被分解代谢的葡萄糖是造成牙龈局部长期处于炎症状态的可能诱因。结合本研究结果提示，唾液微生物群落改变导致的糖代谢能力受损可产生与糖尿病类似的风险。当唾液微生物群落对葡萄糖等糖类物质的转运和分解能力降低时，口腔中的葡萄糖无法被充分分解利用。得益于龈沟液与唾液间存在的交通^［^40 ］，大量葡萄糖从高浓度的龈上环境进入龈下并堆积，导致氧化应激和AGE增多，损害了牙龈局部的防御能力，炎症风险升高，为牙周炎的发生创造了适宜土壤。近年多项研究同样支持本研究的观点。Belstrøm等^［^41 ］研究发现，牙周炎患者龈下菌斑微生物糖代谢能力同样受损；而另有一项研究指出，D-氨基葡萄糖6-磷酸具有减轻胰岛素抵抗的能力^［^42 ］。在本研究中，此代谢产物在牙周炎来源的唾液中显著减少。在物种组成方面，本研究牙周炎组的唾液菌群中检出牙龈卟啉单胞菌和普雷沃菌属的丰度更高。该结论与以往研究一致，同时也进一步明确了牙龈卟啉单胞菌与普雷沃菌在牙周炎发生中的重要作用^［^{43 , 44 ］}。但是，本研究同样发现，与HH组相比，尽管在种水平上牙龈卟啉单胞菌的差异最显著，而在属水平上则是普雷沃菌的差异更显著。造成这种种属水平不一致的原因分析如下：在属水平分析差异时，需要计算包含在该属水平下各菌种的具体组成丰度，而在分析种水平差异时，则只需具体到某一菌种。因此，某一菌种的差异显著性在被纳入属水平时，可被极大程度地稀释。而只有当某一菌属组成成员在丰度、均匀度上存在较大差异时，才显示出属水平差异。因此，这一结果也间接证实普雷沃菌属在牙周炎和健康人群间多样性的差异，这种差异可能与牙周炎的发生密切相关。

近年，利用菌群作为生物标志物预测疾病发生的研究同样受到关注^［^{45 , 46 ］}。而相较于肠道菌群，唾液的采集更简便，例如使用唾液菌群作为新型冠状病毒感染的生物标志物，诊断效率可达87.24%^［^47 ］。在此类微生物组学研究中，一般通过比较筛选出各组间最显著的物种或代谢产物作为潜在的生物标志物^［^{48 , 49 ］}，本研究沿用了此思路。在本研究中，苍白普雷沃菌及3-羟基-1，5-二苯基戊烷-1-酮为龋病组中差异最显著的菌种和代谢物；而牙龈卟啉单胞菌及N1-乙酰精胺可能为牙周炎组中差异最显著的菌种和代谢物，且上述两种代谢物的AUC值分别为0.99和0.90，预测的准确度较高。本课题组后续将开展前瞻性队列研究，进一步探索上述生物标志物是否可用于龋病和牙周炎的早期临床预测。

本研究同样存在一定不足。首先，作为一项横断面研究，本研究结果只能说明糖代谢与疾病发生之间存在潜在的联系，并不能直接说明二者之间存在因果关系。此外，由于准入和排除标准较严苛，纳入研究的每组样本量较小，可能导致研究结果不够全面。最后，由于未能开展转录组测序工作，宏基因组得到的仅为DNA丰度，丰度高不一定代表功能表达上的活跃，在对此类结果的解释应慎重。因此，在后续工作中，课题组将继续收集相关的临床样本，扩大样本量，并尝试改进样本收集方法，进一步证实研究结论。通过开展前瞻性队列研究，判断上述涉及的物种和代谢产物能否作为预测龋病或牙周炎发生风险的生物标志物。同时，尝试通过体外培养的方式，验证菌群糖代谢功能，尤其是糖类分解相关功能的改变，是否是导致龋病和牙周病不同转归的影响因素。最终，希望通过本研究指导临床，筛查龋病和牙周病的高风险人群，通过针对性预防，降低这两种口腔常见病的发生率。

利益冲突 所有作者声明不存在利益冲突

作者贡献声明 吴昊泽：收集标本、数据整理、统计分析、论文撰写；张晓：收集标本、数据整理；程小刚：提出研究思路、研究方法指导、论文修改、资金支持；余擎：课题负责人、提出研究思路、研究方法指导、论文修改、资金支持

（参考文献略）

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