PCR时“模板DNA”加多了会发生什么?

创业   2024-11-24 18:06   浙江  

文章来源于分子庄园,作者木子庄主


1、形成竞争性抑制


过多的模板分子会与聚合酶、dNTPs、引物或其他反应组分形成非生产性的复合物,形成竞争性结合,减少有效催化反应的机率和效率。



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2、导致非特异性扩增


过量的模板可能导致引物与非目标区域的结合增加,引起引非特异性扩增。



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非特异性扩增不仅消耗反应试剂,还会干扰有效扩增,影响特异性扩增的效率和产量。


3、影响酶动力学


在反应混合物中DNA浓度过高会影响酶的动力学特性,降低其反应速率。


1)酶分子的过饱和结合


过高的底物浓度使酶分子和底物的结合饱和,可能影响其结构进而改变其活性状态。


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2)反应条件的改变


①体系粘度增加


过高的DNA模板浓度会引起反应混合物的粘度增加,影响反应物的扩散和酶的活性,进一步抑制扩增效率。


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②影响pH值


DNA是两性电解质,既含有呈酸性的磷酸基团,又含有呈弱碱性的碱基,可发生两性解离。



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过量的DNA可能改变反应体系的pH值,这种改变可能不利于聚合酶的最优活性。


③干扰辅因子的可用性


过量的DNA模板(过量DNA带来大量的负电荷)可能螯合反应体系中的Mg²⁺等重要辅因子,而Mg²⁺等是Taq DNA聚合酶和其他聚合酶发挥活性所必需。镁离子的减少会直接降低聚合酶的活性,影响其在模板上的滑动和新链的合成。

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4、总结


过量的模板DNA会抑制PCR扩增效率。 



有研究发现,当模板DNA浓度从10ng/μL增加到100ng/μL时,PCR扩增效率会显著下降。另一项研究发现,当模板DNA浓度从100ng/μL增加到1000ng/μL时,PCR扩增效率会完全被抑制。


参考文献:

[1]过量的DNA会抑制聚合酶的活性吗?-科研区域

[2]过量的DNA会抑制聚合酶的活性吗?-知乎


文章来源于分子庄园,作者木子庄主

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