NC丨伦敦帝国理工学院Rodrigo Ledesma-Amaro教授团队工程化交叉喂养创造增强生物生产的种间和种内合成酵母群落

在改善微生物菌株的能力方面取得了方法上的进步，但仍然存在一些常见的挑战，包括由于高水平的途径工程、辅因子失衡或中间体和/或最终产物的毒性而导致的代谢负担。为了克服单底盘菌株工程化的缺点，提出了在生物过程中通过工程化多菌株合作建立合成微生物群落的方法。通过在多个菌株之间分工，合成菌群能够提高每个成员的功能，减少代谢负担和工程复杂性，并实现与天然菌群一样的高效率生产。在自然群落中，各种细胞间的相互作用决定了群落的动态，如竞争、共生、互惠或中立。当涉及到合成联盟时，在成员之间设计适当的交互对于构建一个稳定和健壮的合成系统至关重要。一种互惠的相互作用，交叉喂养或共生，需要每一种相互依赖生存的群体，通过将菌群成员联系在一起，可以使菌群能稳定的共存。实现交叉喂养的一种方法是使用不同营养缺陷型菌株交换必需氨基酸，使彼此能够生长。

通过工程交叉喂养行为

建立Y. lipolytica群落

为了评估Y. lipolytica的营养缺陷型菌株是否能通过交换必需代谢物形成共生群落，构建了赖氨酸、色氨酸、蛋氨酸、尿嘧啶和亮氨酸的营养缺陷型菌株Δlys5、Δtrp2、Δtrp4、Δmet5、Δura3和Δleu2。在不添加氨基酸的情况下，以1:1的接种比例在YNBD培养基中对这6种营养缺陷型菌株的15对组合进行生长试验。观察到生长和葡萄糖消耗之间呈正相关，具体取决于营养缺陷型对。在∆trp2和∆trp4的组合中发现了最短的滞后期，并且在培养36小时时达到稳定期。虽然最与其他组合相比，∆Trp2和∆Trp4的OD₆₀₀没有表现出最高的增长率。一些合成群落的漫长滞后阶段可能是由于每个种群需要调整其代谢以输出其伙伴所需的代谢物，和/或输入从伙伴处分泌的代谢物。

图1 Y. lipolytica营养缺陷型菌株的共生共培养

合成交叉喂养群落生长动力学特征

通过将接种比例从10：1改变到1：10来表征三对选定对(∆ura3-∆trp4、∆trp4-∆met5和∆trp2-∆trp4)的种群动态。接种比例的变化在生长模式上表现出相当大的差异，这表明某些群体比例有利于共生生长。在Δura3-Δtrp4对中，接种比例为10:1和5:1时的滞后期较其他比例短，这表明在培养开始时具有更多Δura3菌株的重要性。尽管这些比例的滞后期较短，但所有接种比例在120小时时达到相似的最终OD₆₀₀。此外，无论初始比例如何，种群在稳定期结束时趋于稳定，保持Δura3：Δtrp4的比例在1:1.2和1:1.8之间。对于Δmet5-Δtrp4对，初始比例为1:1,1:5和1:10的共培养比10:1和5:1的共培养更早开始生长。在10:1和5:1的比例下，共培养物在48 h前表现出温和的生长，随后进入指数期。最终的OD₆₀₀与接种比在1:10~10:1相关，也与葡萄糖消耗相关。在稳定期，所有种群比例都稳定在1:1.0~1:1.9之间。

与其他组合相比，Δtrp2-Δtrp4组合在所有接种比例下均表现出更快的生长速度。1:10的延迟最短，其次是1:5和1:1，而5:1和10:1的延迟期较长，最终OD600较低。由于突变Δtrp2和Δtrp4都位于相同的色氨酸合成途径中，因此这两种营养缺陷型菌株之间的生长是通过交换中间体来实现的，这些中间体已知是酿酒酵母中的邻氨基苯甲酸酯和吲哚/色氨酸。在酿酒酵母中，以1:1的比例接种后，Δtrp2菌株高度富集。同样，在10:1和5:1的接种比例下，Y. lipolytica共培养中发现了大多数是Δtrp2菌株，与其他接种比例相比，其生长速度较慢且较低。然而，在Y. lipolytica中，生长较好的比例呈现出不同的群体动态，在接种比例为1:5和1:10的情况下，稳定期Δtrp2：Δtrp4的比例为1:1.5。这两个物种之间明显不同的种群动态表明Y. lipolytica和S. cerevisiae之间的代谢物交换率或机制存在差异。

图2  不同接种比例的营养缺陷型菌株之间的共培养生长和种群

在Y. lipolytica和S. cerevisiae之间建立交叉喂养群落

在证明了两种Y. lipolytica营养缺陷型菌之间形成稳定的交叉喂养共培养后，测试是否可以在Y. lipolytica和S. cerevisiae这两种物种之间建立共生生长。选择Y. lipolytica营养缺陷型菌株(YLΔtrp2、YLΔtrp4、YLΔmet5和YLΔlys5)和S. cerevisiae营养缺陷型菌株(SCΔtrp2、SCΔtrp4、SCΔmet5，和SCΔlys5)。三对(YLΔtrp2-SCΔtrp4、SCΔtrp2-YLΔtrp4和SCΔmet5-YLΔtrp4)在种间共培养中显示出共生生长。生长动力学因所涉及的营养缺陷型和物种而异。由于SCΔtrp2-YLΔtrp4对比其他营养缺陷型对表现出更高的生长率，通过不同的接种比例进一步表征了SCΔtrp2-YLΔtrp4和YLΔtrp2-YLΔtrp4的种群动态。两种共培养物在1:1、1:5和1:10初始比例下均表现出较好的生长效果。然而，接种比例为10:1和5:1的SCΔtrp2-YLΔtrp4未能生长，这可能表明在这些条件下中间体(邻氨基苯甲酸酯)的交换不足以使SCΔtrp2生长。在稳定期，SCΔtrp2-YLΔtrp4的种群比例稳定在1:0.9和1:1.5之间，这与SCΔtrp2-SCΔtrp4共培养的种群分布偏态不同。

图3  Y. lipolytica (YL)和S. cerevisiae (SC)营养缺陷型菌株的共养共培养

交叉喂养群落分工改善3-羟基丙酸生产

将群落中不同菌株的代谢途径分开可以有效地促进生物生产，因为它可以减轻代谢负担并避免瓶颈或有毒中间体。为了验证这一概念，选择β-丙氨酸和丙二酸半醛的生物合成途径。这一途径需要三种酶的表达，即天门冬氨酸-1-脱羧酶(TcPAND)、β-丙氨酸-丙酮酸转氨酶(BcBAPAT)和3-羟丙酸脱氢酶(EcYDFG)。3-HP通路分为表达TcPAND的模块P和表达BcBAPAT和EcYDFG的模块B。每个模块整合到两个不同的营养缺陷型菌株中，从而产生一个依赖于β-丙氨酸从一个菌株到另一个菌株的运输来产生3-HP的群落。

首先，测试了具有劳动分工的种内Y. lipolytica群落，并将其与两种WT对照，单培养和共培养进行了比较。WT单一培养携带三种酶，不分工；WT共培养由两种菌株组成，一个含有模块P (WT-P)，另一个含有模块B (WT-B)，从而实施分工但不交叉饲喂。WT单一培养和WT共培养之间的生长相当。与WT单一培养相比，WT共培养中3-HP的产量低两倍，这表明没有交叉喂养的劳动分工是无益的。在交叉摄食群落中，菌株Δtrp2与模块B (Δtrp2-B)和菌株Δtrp4与模块P (Δtrp4-P)的接种比例不同，其生长也不同。当初始比例为1:10 (Δtrp2-B：Δtrp4-P)时，经过48小时的培养，合成菌群的OD600与WT单株相近。但初始比例为1:1和10:1的共培养导致生长较低。代谢物产量随接种比例的变化有显著差异。1:10的比例共培养显示出与WT单培养相当的3-HP产量(0.26 mM)。以初始比例为10:1的Δtrp2-B与Δtrp4-P共培养，3-HP产量为4.67 mM，是WT单培养的19.3倍。相反，WT单培养比共培养产生更高的柠檬酸盐。群落中B模比越高，3-HP产量越高，说明β丙氨酸转化为3-HP比L-天冬氨酸转化为β-丙氨酸更重要，以实现更高的3-HP产量。

由于Y. lipolytica和S. cerevisiae之间成功建立了交叉摄食群落，因此决定研究这一种间群落的分工。采用不同初始接种比例培养具有不同3-HP合成模块的菌株对YLΔtrp2-SCΔtrp4和SCΔtrp2-YLΔtrp4。与没有3-HP生物生产模块的共培养结果一致，根据接种比例的不同，观察到不同的生长和代谢物谱。3-HP的生产因用于3-HP生产的物种和模块的组合而异。当B:P=10:1时，获得较高的3-HP产量，这与Y. lipolytica种内群落的结果一致。这也证明了在合养群落中β-丙氨酸从Δtrp2-P菌株到Δtrp4-B菌株的有效运输。在SCΔtrp2-B:YLΔtrp4-P比例为10:1时，种间群落的3-HP产量最高，达到4.50 mM，分别是WT单培养S. cerevisiae和Y. lipolytica的40.3和18.6倍。这些结果成功地证明了在两种类型的合成交叉取食群落中，通过途径分裂（以及可能的分工）可以提高3-HP的产量。

图4  共养群落中3-羟基丙酸生物生产的分工